VCAN通过PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖

谢强 钱军 张明亮 张立功 郭晨旭 许睿

[摘要] 目的 探讨多能蛋白聚糖（VCAN）通过PI3K/AKT信号通路对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响。 方法 利用Western Blot和qRT-PCR检测VCAN在正常人乳腺细胞MCF-10A和三株乳腺癌细胞中的表达水平。选取VCAN高表达细胞株MDA-MB-231为实验对象，实验分组为NC组、siRNA1-VCAN组和siRNA2-VCAN组。采用MTT法及克隆形成法检测转染后的乳腺癌细胞增殖变化。Western Blot检测p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K的蛋白相对表达水平。 结果 与正常人乳腺细胞相比，VCAN在乳腺癌细胞中的表达量显著上升（P<0.05）。下调VCAN表达量，MDA-MB-231细胞的增殖显著被抑制（P<0.05）。同时，下调VCAN表达量，p-AKT、p-PI3K蛋白水平显著下降（P<0.05）。 结论 VCAN在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，可能通过 PI3K/AKT 信号通路调控细胞增殖能力。

[关键词] VCAN;乳腺癌;细胞增殖;PI3K/AKT

[中图分类号] R730.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）36-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of versican（VCAN） on the proliferation of breast cancer cells MDA-MB-231 through the PI3K/AKT signaling pathway. Methods Western Blot and qRT-PCR were used to detect the expression level of VCAN in normal human breast cells MCF-10A and three breast cancer cells. The VCAN high-expressing cell line MDA-MB-231 was selected as the experimental object， a nd they were divided into the NC group， siRNA1-VCAN group， and siRNA2-VCAN group. The MTT method and clone formation method were used to detect the proliferation of breast cancer cells after transfection. Western Blot was used to detect the relative protein expression levels of p-AKT， AKT， p-PI3K and PI3K. Results Compared with that of the normal human breast cells， the expression of VCAN in breast cancer cells increased significantly（P<0.05）. When the expression of VCAN was down-regulated， the proliferation of MDA-MB-231 cells was significantly inhibited（P<0.05）. At the same time， the expression of VCAN was downregulated， and the protein levels of p-AKT and p-PI3K decreased significantly（P<0.05）. Conclusion VCAN may regulate cell proliferation through PI3K/AKT signaling pathway in breast cancer MDA-MB-231 cells.

[Key words] VCAN; Breast cancer; Cell proliferation; PI3K/AKT

乳腺癌是全球癌症最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率位居第一，严重威胁着全球女性的健康[1]。尽管采取了标准的治疗策略，包括手术切除、放疗或化疗，其预后仍不理想[2-3]。因此，进一步研究其发病机制对于乳腺癌的早期诊断和治疗至关重要。多能蛋白聚糖（Versican，VCAN）是一种大型聚集性硫酸软骨素蛋白多糖，是聚集蛋白聚糖家族的成员。该蛋白参与细胞黏附、增殖、迁移和血管生成，并在组织形态发生和维持中起关键作用。VCAN是重要的细胞外基质成分，与肿瘤发生密切相关，已鉴定出四种VCAN亚型。VCAN表达异常已在多种肿瘤中报道，如胃癌[4]、胰腺癌[5]、卵巢癌[6]和膀胱癌[7]，并与不良后果相关。先前的研究表明，VCAN可改善肿瘤细胞的存活、生长[8]、迁移[9]、侵袭、血管生成和转移。PI3K/AKT（Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B）信号通路是细胞内最重要的信号通路之一，在促进细胞生长、增殖、转移、侵袭，抑制细胞凋亡，促进血管生成，抵抗化疗并产生耐药性等方面起到重要的作用[10]。已有文献报道VCAN可能影响膀胱癌的预后，富集分析发现其可能通过PI3K/AKT信号通路影响膀胱癌预后[7]。同时，在胃癌中也发现VCAN通过PI3K/AKT信号通路影响胃癌的预后。然而，目前关于VCAN在乳腺癌中PI3K/AKT的关系尚不清楚。因此，本研究以乳腺癌細胞MDA-MB-231为研究对象，特异性地敲低VCAN表达，观察VCAN是否影响乳腺癌细胞增殖，并进一步探讨其作用机制，为乳腺癌的临床治疗提供一定帮助。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及细胞培养

MCF-10A正常人乳腺细胞和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7、SKBr3购于中科院细胞研究所。MCF-10A细胞、MDA-MB-231、MCF-7、SKBr3细胞采用RPMI1640培养基进行培养。四种细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。在37℃、5% CO2、95%湿度条件下的培养箱中，当细胞长至70%融合率时，进行消化传代。

1.2 主要试剂

siRNA、NC均购于上吉玛制药技术有限公司， RPMI-1640培养基和胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司，胰蛋白酶购自美国Hyclone公司。Trizol和Lipofectamin2000试剂盒购于美国Invitrogen公司， cDNA试剂盒及SYBR Green试剂盒购于北京全式金公司。一抗（VCAN、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K、GAPDH）购于武汉三鹰生物科技有限公司，二抗购于中国Affinity公司。四甲基偶氮唑盐（MTT）购于Biofroxx公司。

1.3 细胞转染

取生长状态良好的细胞进行转染操作，当细胞融合达到70%时，按照说明书进行转染操作，实验分组为NC组（Lip2000和NC序列）、siRNA1-VCAN组（Lip2000和siRNA1-VCAN序列）和siRNA2-VCAN组（Lip2000和siRNA2-VCAN序列）。siRNA1-VCAN序列为5'-GGGAGUUCUUCGAUUCCAA-3';siRNA2-VCAN序列为5'-GAGGCUGGAACUGUUAUUA-3'。

1.4 实时荧光定量PCR检测 mRNA 表达

采用Trizol提取细胞总RNA。将提取的总 RNA 按 RNA反转录试剂盒（cDNA合成试剂盒）说明操作进行反转录，总 RNA反转录为 cDNA。合成的cDNA按照SYBR Green试剂盒说明书通过PCR仪进行扩增检测，以GAPDH为内参。最终Ct值采用 2-ΔΔCt方法分析。采用两步PCR扩增标准程序进行实时荧光定量PCR：步骤1： 预变性（95℃，30 s） ;步骤2： PCR反应（95℃ 5 s，60℃ 30 s） ，共40个循环。所有试验均重复3次。VCAN引物序列F： 5'-CCACGCTTCCTATGTGA-3'，R：5'-TTTCCCACTTTGACTTTATGT-3'。GAPDH引物序列F：5'-TCTCTC-CTCCTCCTGTTCG-3'，R：5'-GCGCCCAATAG-GACCAAATC-3'。

1.5 细胞活力检测

细胞以5×104浓度接种于96孔板，每组4个复孔，置于培养箱中继续培养 24、48、72 h。在对应的时间点加入MTT，继续培养2～4 h，加入DMSO溶解，用酶标仪在490 nm测定吸光度并绘制生长曲线。

1.6 克隆形成法检测细胞增殖能力

乳腺癌细胞MDA-MB-231经转染干扰序列处理48 h，6孔板中每孔接种1500个细胞，置于培养箱培养10 d至克隆形成，除去培养液，用PBS洗2次，用5%多聚甲醛固定20 min，5%结晶紫染色室温孵育20 min，用双蒸水洗涤2次。室温干燥，观察克隆形成情况，大约200个细胞集落为一个克隆。

1.7 Western Blot法检测PI3K、AKT相关蛋白表达水平

使用细胞裂解液将MDA-MB-231细胞裂解过夜。随后在4℃、14 000 g 离心30 min，收集上清液。BCA法测量蛋白质浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并用 PVDF膜转膜。将膜在含有5% BSA封闭液中封闭2 h，并分别与 VCAN（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、PI3K （1∶1000）、AKT（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）及GAPDH（1∶1000） 等一抗4℃ 摇床孵育过夜，洗膜后在室温与二抗兔抗（1∶1000）孵育2 h。配置超敏ECL显影液，在凝胶成像仪中对条带进行显影。

1.8 统计学分析

采用SPSS23.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较则采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VCAN在不同乳腺癌细胞系中的表达水平。

通过Western Blot及qRT-PCR方法检测VCAN在不同乳腺癌细胞系中的表达水平，结果显示，与人乳腺细胞上皮细胞MCF-10A相比，乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和SKBr3中的VCAN表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。MDA-MB-231细胞中的VCAN表达水平在乳腺癌细胞中最高，因此以MDA-MB-231细胞株作为实验对象。见图1。

2.2 Western Blot及qRT-PCR检测转染后细胞中VCAN的表达水平

Western Blot（图2A）和qRT-PCR（图2C）结果显示，乳腺癌细胞MDA-MB-231转染后，siRNA1-VCAN组和siRNA2-VCAN组的mRNA及蛋白表达量，与NC组相比下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 MTT检测转染后乳腺癌细胞的增殖作用

MTT结果显示，敲低VCAN表达后，乳腺癌细胞MDA-MB-231生长受到显著抑制。培养48 h和72 h时siRNA1-VCAN组、siRNA2-VCAN組与NC组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。说明VCAN表达下降可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231体外增殖的能力。见封三图1A。

2.4 克隆形成实验

siRNA1-VCAN组和siRNA2-VCAN组的细胞克隆形成能力与NC组相比下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）。说明VCAN表达下降可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖。见封三图1B。

2.5 沉默VCAN对PI3K/AKT信号通路的影响

Western Blot实验结果显示，敲除VCAN表达水平后，与NC组比较，siRNA1-VCAN组与siRNA2-VCAN组的AKT、PI3K蛋白水平，差异无统计学意义（P<0.05），p-AKT、p-PI3K蛋白水平显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。说明沉默VCAN表达水平后，PI3K/AKT信号通路显著抑制。见图3。

3 讨论

乳腺癌是全世界三种最常见的癌症之一。早期乳腺癌被认为可能是可治愈的[11]。虽然近年来乳腺癌研究取得了巨大进展，但乳腺癌仍是一个主要的健康问题[12]。当前的治疗策略是有限的，并与许多副作用相关。因此，需要寻找强大而新颖的治疗靶点来遏制乳腺癌的发病率不断上升[13]。

VCAN是一种蛋白质编码基因。与VCAN相关的疾病包括相关的玻璃体视网膜病变和Wagner综合征。有研究表明[14]，VCAN通过miR-124调控黑色素瘤细胞的增殖。同时，VCAN也被证明参与肾癌增殖、转移过程[15]。以上研究表明，VCAN在肿瘤的增殖过程中起着至关重要的作用。PI3K/AKT信号通路参与乳腺癌细胞的增殖、分化和迁移[16]。该通路一方面调控细胞增殖和分裂，另一方面控制细胞凋亡。目前，PI3K/AKT通路的研究主要集中于肝癌[17]、结肠癌[18]、卵巢癌[19]、胃癌[20]等方面，其尚未见VCAN基因在乳腺癌中的报道。部分研究报道，VCAN通过PI3K/AKT通路影响膀胱癌和胃癌預后。然而其在乳腺癌中的作用尚未报道。因此，本研究准备探讨VCAN与PI3K/AK通路在乳腺癌中的关系。

在前期实验中发现，沉默了VCAN的表达量，可以抑制AKT磷酸化的水平，从而影响PI3K/AKT通路的激活。因此，VCAN可能通过PI3K/AKT通路影响乳腺癌细胞的增殖。本研究通过Western Blot和qRT-PCR方法发现VCAN在乳腺癌细胞系中表达量上升。说明VCAN在乳腺癌细胞中可能是一个癌基因。并根据细胞株的表达情况以VCAN高表达细胞株MDA-MB-231细胞为研究对象，敲低VCAN表达水平，通过克隆形成实验和MTT实验发现，细胞增殖能力受到显著抑制。PI3Ks是由不同基因编码的调控和催化亚基组成的异二聚类脂质激酶。AKT是PI3K的下游效应因子，调控许多生物学过程，包括增殖、凋亡和生长。乳腺癌中也有PI3K/AKT通路异常激活的报道[21]。敲低VCAN，p-AKT、p-PI3K蛋白水平显著下降。AKT、PI3K蛋白是PI3K/AKT信号通路的关键分子，而其磷酸化水平代表着PI3K/AKT信号通路。因此，VCAN的敲低能够明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中的AKT和PI3K的激活，进而抑制PI3K/AKT信号通路。

综上所述，敲低VCAN能够通过抑制PI3K/AKT信号通路从而抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力，提示VCAN在乳腺癌的增殖中起到关键作用，其在今后可能成为一个临床治疗靶点。

[参考文献]

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