中国荷斯坦奶牛angptl5基因多态性及其与乳品质性状的相关分析

潘子意，靳子康，高 振，刘 娟，Shaokat Ali，姜 平，赵志辉

(广东海洋大学 动物科学学院，广东 湛江 524000)

荷斯坦奶牛是于19世纪末期引入中国，是目前世界上产奶量高、群体较大的奶牛优势品种，引入我国后与中国黄牛杂交，在长期的选育过程后，逐渐形成更具特色的中国荷斯坦奶牛[1]。1999年KIM等[2]利用人类和小鼠心脏组织的cDNAs为模板，采用同源PCR扩增的方法克隆出的cDNA，结果发现其在组成上与血管生成素具有一定的同源性，因此命名为血管生成素样蛋白(angptls)。虽然angptls与Ang具有一定的同源性，其蛋白质的氨基端和羧基端分别含有相同的CCD和FLD区，但不能与酪氨酸受体Tie1或Tie2结合，在功能上也表现出更多的多样性[3]。根据目前的研究报道ANGPTLs家族共有8个成员(ANGPTL1～ANGPTL8)，其中ANGPTL1～7都具有Ang典型的N端和C端卷曲-螺旋结构域，以及纤维蛋白原样结构域[4-9]。赵阳玫等[10]发现angptl1、angptl2基因在肉鸭不同时期不同部位的脂肪组织沉积相关，并且发现在同一时期中angptl2在不同部位脂肪的表达量均显著高于angptl1。在此基础上，SHIMIZUGAWA等[11]证明ANGPTL3是通过抑制生理和病理学上的脂蛋白脂肪酶的活性来调节极低密度脂蛋白的甘油三酯水平。KÖSTER等[12]通过采取针对基因编辑的方法产生缺失angptl3、angptl4基因以及angptl4基因过表达的转基因小鼠，结果发现angptl4转基因小鼠与敲除angptl3、angptl4基因的小鼠相比前者血浆中脂蛋白脂肪酶的活性降低导致甘油三酯的含量显著增加。这一结果进一步说明angptl3的缺失可以增加脂蛋白脂肪酶的活性从而降低血浆中甘油三酯的含量。目前对于angptl5基因的研究主要集中在对人类造血干细胞的影响[13-18]。据MIRZAEI等[16]报道ANGPTL6是一种环状抗肥胖的蛋白质，能够改善人类的血脂水平。近些年除了COMES等[17]提出ANGPTL7在青光眼疾病中起作用之外，ABU-FARHA等[18]的数据首次表明肥胖会增加血浆和脂肪组织中的ANGPTL7的表达水平。ANGPTL8是ANGPTLs家族的最新成员，与甘油三酯和葡萄糖代谢有关。WANG等[19]发现angptl8基因敲除小鼠由于脂肪沉积缓慢，生长速度及生长发育性能也比野生型小鼠迟缓，严重影响了小鼠甘油三酯的代谢进程。

近些年对于angptl5基因的相关报道较少。2002年ZENG[20]等通过对人类大脑cDNA的大规模测序，克隆出了一种新的人血管生成素样cDNA并称之为血管生成素样5(ANGPTL5)。据ZENG等[20]的生物信息学推测ANGPTL5蛋白末端具有裂解信号肽的卷曲结构以及纤维蛋白原样结构域。根据ANGPTL5的表达分析，其主要在成人心脏中进行表达。ZHENG等[15]采用免疫荧光染色的方法结果显示angptl5能够激活人脐带血CD34+细胞中的MAPK和Stat5信号传导途径。并且通过荧光定量PCR方法发现，angptl5能够提高hoxB4、Bmi-1和EZH2基因的表达水平，同时能够抑制骨髓、红细胞和淋巴分化相关基因的表达。

本课题组前期的基因组学分析发现，angptl5基因在高脂奶牛和低脂奶牛的乳腺上皮细胞中差异表达，但angptl5基因对中国荷斯坦奶牛乳品质性状的影响研究鲜有报道。因此，本试验以angptl5基因为候选基因，对中国荷斯坦奶牛angptl5基因进行扩增，通过直接测序的方法筛选该基因的单核苷酸多态性位点，分析其在群体中的遗传效应，并与乳品质相关性状进行关联分析。本试验结果为未来探索angptl5基因在中国荷斯坦奶牛体内的生物学功能和优质奶牛育种标记选择提供分子理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料本试验中所选用的113头中国荷斯坦奶牛，在相同的饲养管理条件下饲养于黑龙江某牛场，收集牛尾静脉血液(5 mL/头)用抗凝剂处理后，放在-80℃冰箱储存。

Taq PCR Mix(Vazyme)，Trizol、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)，DNA loading Buffer，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根)，琼脂糖(北京鼎国生物技术有限公司)，溴化乙锭替代物。

实验仪器设备：伯乐T100梯度PCR(Bio-Rad)；天美电子天平分析天平FA1204B(上海精科)；-80℃超低温冰箱、HL-300制冰机(SANYO)；电泳仪(北京六一)；TGear微型离心机(北京天根科技)；LX系列400小型离心机(北美离心机)；凝胶成像分析系统；高速台式离心机、NanoDrop 2000(Thermo)。

1.2 DNA提取使用血液基因组DNA提取试剂盒，按照说明书对中国荷斯坦奶牛血液样本进行DNA提取。DNA的纯度与浓度使用NanoDrop ND-2000超微分光光度计(Thermo Fisher Scientific)进行测定，使用琼脂糖凝胶电泳对DNA的质量进行检测。

1.3 引物设计根据Ensembl中公布的牛angptl5基因序列(ENSBTAG00000005308)，利用Primer Premier 6.0软件设计引物，上游序列：5′-GAATGTCCTGCTGGCATAGAA-3′；下游序列：5′-TGAGAATTACTGTGCTGCTACT-3′，并由金唯智生物科技(苏州)有限公司合成。

1.4 PCR扩增及产物检测PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，上游引物57.8℃、下游引物52.4℃，退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；延伸72℃ 10 min，16℃保存备用。PCR反应体系(20 μL)：Taq PCR Mix 10 μL，引物(上游/下游)各 0.5 μL，模板DNA 2 μL，去离子水7 μL。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送金唯智生物工程(苏州)有限公司测序。

1.5 数据分析采用SeqMan分析，鉴别每一个个体基因型。使用Popgene软件计算等位基因的基因频率、基因型频率、遗传杂合度(H)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)，计算χ2值。利用SPSS 23.0软件的单因素方差中的多重比较分析对中国荷斯坦奶牛产奶性状和基因型间的关系进行差异显著性检验,当P<0.05时表示差异显著，P<0.01 时表示差异极显著。结果使用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1angptl5基因PCR扩增结果以混池DNA为模板，用设计的1对引物进行PCR扩增，结果如图1所示，引物扩增特异性良好。

图1 以中国荷斯坦奶牛混池DNA为模板的PCR产物电泳图 M．DL2000 DNA Marker;1,2. angptl5基因PCR扩增产物

2.2 PCR扩增产物测序结果及angptl5基因SNP位点检测采用直接测序法，对PCR产物进行SNP位点检测，结果表明在该基因内含子发现I1-1776 G>A突变位点，基因型峰图结果见图2。

图2 angptl5基因I1-1776 G>A位点3种基因型的测序结果

2.3angptl5基因I1-1776 G>A位点的群体遗传特性I1-1776 G>A位点的群体遗传特性结果如表1所示。由表1可以看出在I1-1776 G>A位点中优势基因型为AG，优势等位基因为G，其频率大于0.5。I1-1776 G>A位点基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)均处于0.25～0.50，这一结果表明该位点在angptl5基因中呈现为中度多态。χ2检验说明，I1-1776 G>A位点在中国荷斯坦奶牛群体中处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。

表1 angptl5基因I1-1776 G>A位点的群体遗传特性

2.4angptl5基因I1-1776 G>A位点与中国荷斯坦奶牛乳品质性状的相关分析angptl5基因I1-1776 G>A位点与中国荷斯坦奶牛乳品质性状的相关分析结果显示：该SNP位点与奶牛乳品质性状中的尿素氮具有显著相关性(P<0.05)，其中AA基因型具有较高的尿素氮水平，该位点与产奶量、乳蛋白、乳糖、脂肪以及干物质含量均无显著相关性(P<0.05)。

表2 angptl5基因I1-1776 G>A位点与中国荷斯坦奶牛乳品质性状的相关分析

3 讨论

我国每年大量进口荷斯坦奶牛，荷斯坦奶牛拥有其优秀的乳品质并且产奶量较高，因此优良荷斯坦奶牛的选育极有研究价值。乳品质性状主要包括：乳脂率、乳蛋白率、乳糖、产奶量、体细胞数和尿素氮等，其中乳脂是牛奶的主要成分之一，它的组成及含量是影响牛奶口感及营养价值的主要因素。研究上游调控基因对奶牛产奶性能的影响并揭示其调控机理对提高牛奶品质具有重要意义。乳脂率的高低是评定牛奶质量的重要指标，其中可以通过遗传因素及饲养管理因素等来提高牛奶的乳脂率。乳蛋白具有光谱抗菌、调节机体免疫功能、抗氧化功能以及调节铁离子的吸收的重要作用。乳糖和其他糖类一样能够为机体提供能量。牛奶中体细胞数是指牛奶中的细胞总数，能够反映牛奶的质量及奶牛的健康状况。而尿素氮能够作为判断肾小球过滤功能的指标。

近些年有关angtpls基因的研究主要与人类和家禽的脂质代谢有关[10-13]，而对于奶牛angptl5基因的相关研究报道更少。张慢等[21]通过对湖北省3个牧场的DHI数据分析产奶量与乳成分的相互关系。结果发现研究的3个牛场的产奶量与乳尿素氮呈负相关(P<0.01)。同时赵日浪等[22]为了揭示牛奶尿素氮与日粮能量、蛋白及乳品质之间的相互关系，检测了荷斯坦奶牛与娟姗牛奶的尿素氮含量、乳脂率和乳蛋白率，结果发现：尿素氮浓度与乳蛋白率、乳脂率呈负相关，而尿素氮浓度的高低也会影响奶牛的能量蛋白代谢的平衡。尿素氮在肝脏中合成，作为蛋白质代谢的终产物，最终经肾脏排出，是衡量肝脏和肾脏蛋白质代谢的正常指标。由此可以推测angptl5可能会降低血浆脂蛋白脂肪酶活性，导致血浆内乳糜颗粒(CM)的增加，从而使甘油三脂水解为甘油和脂肪酸减少。而这些乳糜微粒可以被肝细胞上的apoE受体识别并将其吞噬至肝细胞与细胞溶酶体结合，这一过程肝脏中的载脂蛋白过多的被水解为氨基酸，而这些过多的氨基酸在肝脏中被代谢分解为尿素，合成的尿素进入血液，导致血液中尿素氮的含量增加[23-24]。因此本试验通过直接测序法对113头中国荷斯坦奶牛进行SNP筛选及其与乳品质性状的相关分析。结果显示AA型个体所产生的尿素氮显著高于AG和GG型个体，可以推测AA型个体的脂蛋白脂肪酶的活性被显著降低导致个体的尿素氮的合成高于排泄，可能会导致血液中尿素氮的沉积引起中毒现象。尿素氮的含量可部分反映动物体内蛋白质水平，也能够评估牛日粮体系中的瘤胃降解蛋白(RDP)和瘤胃非降解蛋白(RUP)的配置情况，还可以进一步借助这一指标评价牛群的健康情况、繁殖效率和泌乳奶牛日粮蛋白的利用率等。同时结果显示I1-1776 G>A处于中度多态并使用χ2检验证明，I1-1776 G>A处于哈代温伯格平衡状态，表明个体受到人工选择的影响较小。

本试验首次发现中国荷斯坦奶牛angptl5基因I1-1776 G>A位点的突变显著影响了中国荷斯坦奶牛的尿素氮的含量，为日后探索angptl5基因在牛体内生物学功能和奶牛育种标记选择提供分子理论依据。