月桂酸对青春期小鼠乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育的影响

王佳鑫，曹 宇，李 雯，葛玉松，付守鹏，柳巨雄

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春130062)

乳腺是哺乳动物哺育后代的唯一器官，乳腺的发育程度直接决定幼畜的生长状况[1]。乳腺发育经历了几个不同的时期，包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期,其乳导管分支及终末端的形成主要发生于青春期[2]。而乳腺腺泡细胞的分化及泌乳的启动主要发生于妊娠期和泌乳期。因此，青春期乳腺的发育程度直接决定了泌乳期腺泡细胞的数量[3-4]。

乳腺组织的发育受到许多激素和生长因子的调控，此外，乳腺发育也受到脂肪酸的影响[5-6]。据报道，高脂饮食喂养的小鼠乳腺上皮细胞增殖减少，乳腺发育受阻[7]。添加油酸可促进青春期小鼠乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育[8]。由此可见脂肪酸在乳腺发育中起重要作用。月桂酸主要存在于椰子油(45%～52%)和棕籽油(44%～52%)中。已有报道，月桂酸有良好的抗菌作用且有利于烧伤组织的再生，并可预防由睾酮引起的大鼠前列腺增生[9-10]。已有研究发现，饲粮中添加月桂酸可影响大鼠乳汁中脂肪酸的分泌，哺乳期母鼠饲粮中添加月桂酸可增加子代小鼠平均体质量[11-12]。因此我们推测，月桂酸可能通过影响乳腺发育从而改变泌乳。本研究通过体外向mMECs中添加月桂酸和体内饲喂月桂酸的方式，研究月桂酸对青春期小鼠乳腺发育的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和处理将mMECs在含有10%FBS的DMEM中于5% CO2的潮湿培养箱中于37℃培养,然后添加不同浓度的月桂酸(0，50，100，150，200 μmol/L)培养1 d。

1.2 CCK-8法将mMECs与月桂酸孵育2 d后，使用CCK8试剂盒检测mMECs的增殖。 将mMECs在37℃下与每个孔中的10 μL CCK8孵育1 h后，用450 nm酶标仪测量吸光度。

1.3 免疫印迹分析使用RIPA裂解缓冲液分离出mMECs和小鼠乳腺的总蛋白，用PierceTMBCA蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离总蛋白并转移至PVDF膜。将PVDF膜与一抗(1∶1 000稀释)在4℃下孵育过夜，然后用HRP偶联的山羊抗小鼠(1∶3 000)或山羊抗兔(1∶3 000)二抗在室温下孵育1 h ，用ECL Plus超敏发光溶液可视化蛋白质条带。

1.4 流式细胞仪分析将mMECs用胰蛋白酶消化并转移到1.5 mL离心管中，在4℃下用1 mL预冷的70%酒精固定12 h，离心3～5 min，除去上清液，保留约50 μL 70%乙醇。加入1 mL预冷的PBS并将细胞重悬，离心细胞，小心除去上清液并保留50 μL PBS。 轻弹管的底部以分散细胞， 向每个样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色溶液，将细胞缓慢完全悬浮，并在黑暗中于37℃保持30 min。使用流式细胞仪(BD LSRFortessaTM)检测细胞周期。

1.5 全组织染色分析通过颈脱位法处死小鼠，打开皮肤，暴露乳腺，摘取乳腺并铺在经4%多聚赖氨酸处理的载玻片上，卡诺氏液固定过夜。将乳腺浸入70%,35%和15%的乙醇中10 min，室温下用胭脂红明矾(2 g / L)染色过夜。染色后将载玻片在酒精中漂洗10 min，浸入二甲苯中使用立体显微镜观察。

1.6 动物和体内试验所有动物试验和护理程序均按照吉林大学动物保护福利规程进行。将出生4周的小鼠分为对照组(喂食对照饮食，n=6)和月桂酸组(饮用水含0.05%,0.10%和1.00%的月桂酸，n=6)，4周后处死小鼠并收集第4对乳腺。将左乳腺冷冻在-80℃用于进一步分析，右乳腺用于组织染色。

1.7 数据分析所有数据均以平均值±标准误表示。 使用t检验和单因素方差分析确定均值之间的差异，P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 月桂酸对细胞增殖的影响CCK8法检测不同浓度月桂酸对mMECs增殖率的影响，结果表明100 μmol/L月桂酸能显著增加mMECs的增殖率，而50,150和200 μmol/L月桂酸对mMECs增殖没有显著性影响(图1)。

图1 不同浓度月桂酸对mMECs增殖的影响

2.2 月桂酸对细胞增殖标志物表达的影响Western blot法检测不同浓度月桂酸对mMECs中细胞增殖标志物表达的影响，结果表明，100 μmol/L月桂酸能显著增加mMECs中Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表达量(图2)。

图2 不同浓度月桂酸对细胞增殖标志物表达的影响

2.3 月桂酸对细胞周期进程的影响流式细胞仪检测月桂酸对细胞周期的影响，结果表明，100 μmol/L月桂酸可显著增加S期细胞，并显著减少G1/G0期细胞(图3)。

图3 100 μmol/L月桂酸对细胞周期的影响

2.4 月桂酸通过ERK信号通路促进细胞增殖标志物的表达有研究表明，ERK1/2信号通路在细胞增殖过程中具有重要作用。因此，我们使用ERK1/2的抑制剂U0126探讨ERK1/2信号通路在月桂酸促进mMECs增殖标志物中的作用。结果表明，月桂酸能显著增加了p-Rb/Rb的比值 (图4A,E)，而U0126可完全阻断月桂酸促进细胞增殖标志物表达的作用(图4A,C,D)，并阻断增加p-Rb/Rb比值的作用 (图4A,E)。

2.5 乳导管及终末端的检测通过胭脂红染色法检测了含有不同浓度月桂酸的饮用水(0.00%,0.05%,0.10%和1.00%)对青春期小鼠乳导管分支及终末端数量的影响,结果表明，饮用水中包含0.05%月桂酸能显著增加青春期小鼠乳导管分支及终末端数量(图5)。

2.6 饲喂月桂酸对青春期小鼠乳腺中细胞增殖标志物表达的影响Western blot法检测了乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表达量,结果表明，0.05%月桂酸显著增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表达量(图6)。

图4 U0126对月桂酸促进mMECs中细胞增殖标志物表达的影响 A.Western blot;B.Cyclin D1;C.Cyclin D3;D.PCNA;E.pRb/Rb

图5 不同浓度月桂酸对青春期小鼠乳导管分支及终末端数量的影响 A.对照组;B.0.05%月桂酸组；C.0.10%月桂酸组；D.1.00%月桂酸组

图6 月桂酸对青春期小鼠乳腺中细胞增殖标志物表达的影响

3 讨论

本研究发现，100 μmol/L的月桂酸通过ERK1/2信号通路促进细胞增殖标志物的表达，进而增加了Rb蛋白的磷酸化水平促进mMECs增殖。此外，饮用水中含0.05%的月桂酸也显著增加了青春期小鼠乳腺中乳导管分支及终末端的形成，并显著增加了Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表达。

乳腺的主要作用是分泌乳汁从而为新生儿提供营养[13]。乳腺上皮细胞是乳导管的重要组成部分，一般来说，乳腺上皮细胞的数量决定了泌乳量。因此，促进乳腺上皮细胞增殖可增加泌乳量[14]。乳腺上皮细胞增殖受激素水平、营养条件等多种因素影响。已有研究表明，长链脂肪酸中油酸、n-3多不饱和脂肪酸等可促进小鼠乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育[8,15]，而硬脂酸则抑制乳腺上皮细胞增殖[16]。月桂酸是一种12碳的中链脂肪酸，我们研究发现，月桂酸可显著促进小鼠乳腺上皮细胞增殖和乳导管的发育。

细胞增殖标志物(Cyclin D1/D3和PCNA)在调控细胞增殖中发挥重要作用。研究表明，Cyclin D1通过结合并激活CDK4/6从而与Rb蛋白结合[17]，进而促进Rb-E2F1复合物解离，从而推动细胞由G1期到S期过渡[18-19]。此外，Cyclin D1的高表达也与乳腺癌的发生具有密切的关联[20]。研究发现，Cyclin D1也可与PCNA结合，进而抑制DNA合成，调控细胞周期进程[21]。PCNA是一种在DNA复制和损伤修复中起重要作用的核蛋白，其在S期的表达明显增加[22]。作为DNA聚合酶的辅助蛋白，PCNA链接着DNA聚合酶在DNA链上滑动，为聚合酶的持续工作发挥作用[23]。Cyclin D3与Cyclin D1的作用相似，可以促进G1/S期的转换，还可以维持终末分化，在已分化组织的静止细胞中普遍高表达，在肿瘤细胞的生长与增殖中起关键作用[24]。已有研究发现，添加高表达Cyclin D3可以有效促进细胞G1/S期转换，当诱导HL-60白血病细胞分化时，Cyclin D3的表达明显增高[25]。在本研究中，100 μmol/L的月桂酸显著增加了mMECs中Cyclin D1/D3和PCNA蛋白的表达量。此外，在体内试验中我们发现，月桂酸不仅促进了乳导管分支及终末端的形成，也增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1/D3和PCNA的表达量。这表明月桂酸可能通过增加Cyclin D1/D3和PCNA的表达进而促进mMECs的增殖。

为了研究月桂酸如何通过细胞增殖标志物的表达来促进mMECs增殖，我们随后检测了与增殖相关的ERK1/2信号通路。此前的研究发现，ERK1/2信号通路的激活可以显著促进肺成纤维细胞的增殖、转化及迁移[26]。也有研究发现，长链不饱和脂肪酸可通过ERK1/2信号通路促进BMECs增殖[27]。本研究在添加ERK1/2抑制剂后发现，月桂酸通过ERK1/2信号通路增加Cyclin D1/D3和PCNA的蛋白表达。此外，月桂酸还增加了p-Rb/Rb的比值，而ERK1/2抑制剂消除了这种作用。这表明月桂酸可能通过ERK1/2信号通路调控细胞增殖标志物的表达来促进mMECs的增殖。

本研究结果表明，月桂酸通过ERK1/2信号通路促进细胞增殖标志物的表达，进而促进青春期小鼠乳腺的发育。