陕西部分地区规模化猪场仔猪隐孢子虫的感染状况分析

姚 倩，王俊伟，王莎莎，李蕴慧，赵姗姗，宋军科，赵光辉

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种呈世界性分布的人畜共患寄生性原虫[1]，可感染人和多种动物，严重危害其健康和生命。隐孢子虫主要寄生于人和动物的胃肠道上皮细胞，造成宿主严重腹泻，幼畜和免疫缺陷型的动物尤为易感，严重时可导致其死亡[2]。人和动物常通过污染的娱乐用水、饮用水、食物或相互接触而遭受感染[3]。

研究发现，猪具有较高的隐孢子虫感染率，由隐孢子虫寄生于猪的肠道而引起的猪隐孢子虫病可导致猪发生以腹泻、精神沉郁、厌食、消瘦等为主要临床症状的消化道疾病，严重影响养猪业的健康发展。1992年，蒋金书等[4]首次对国内猪场隐孢子虫感染情况进行了系统调查，发现隐孢子虫广泛存在于猪场中，且低日龄的仔猪更易感。随后各省市陆续出现猪隐孢子虫病的相关报道，如云南[5]、安徽[6]、上海[7]、河南[8]、重庆[9]等地猪场隐孢子虫的平均感染率分别为13.18%(17/129),4.8%(24/500),20.66%(312/1510),8.89%(127/1429)和16.93%(303/1790)；同时研究发现猪可以感染多种隐孢子虫，其中以种母猪隐孢子虫(C.scrofarum)和猪隐孢子虫(C.suis)最常见[10]。为了摸清陕西省仔猪隐孢子虫病的流行情况，本研究采用基于18S rRNA基因位点的分子生物学技术对陕西省5个地区规模化猪场仔猪的隐孢子虫感染率和种类分布进行了研究，以期为该地区猪场隐孢子虫病科学防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 粪便样品的采集在陕西省周至、岐山、勉县、临潼、榆阳5个地区的5个规模化猪场收集仔猪新鲜粪便样品共375份，包括155份断奶前仔猪(<25 d)和220份断奶后仔猪(1～4 月龄)粪便样品。每份分别单独放入干燥洁净的塑料袋中，详细标记好采样时间、地点、年龄等信息，随后将装有粪便样品的塑料袋放入低温保存箱内，迅速运送到实验室，转移至2.5%的重铬酸钾溶液中，4℃冰箱保存。

1.2 粪便样品隐孢子虫的检测及显微观察取约10 g粪便，加水30 mL搅匀，用80目铜筛过滤。将滤液以3 500 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀加20 mL水搅匀，再加入20 mL乙醚去脂，混匀后3 500 r/min离心10 min，弃上清液，取5 mL粪悬液，加入30 mL饱和蔗糖溶液，混匀后3 500 r/min离心7 min，取其表液膜至载玻片在显微镜下观察。

1.3 粪便基因组DNA提取每份粪便样品取50～150 mg，放入1.5 mL的离心管中，加入适当的蒸馏水反复离心洗涤，直至上清澄澈透明，然后使用粪便基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，USA)，按照说明书进行粪便基因组DNA的提取，提取的DNA样品置-20℃保存备用。

1.4 巢式PCR基于XIAO等[11]报道的引物，利用巢式PCR对每份粪便基因组DNA样品进行隐孢子虫感染情况的检测。巢氏PCR两轮扩增体系均为25 μL。第一轮包括DNA模板1 μL、rTaq酶(5 U/μL)0.125 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dd H2O 15.375 μL、MgCl2(25 mol/L)2.0 μL、dNTP(2.5 mol/L)2.0 μL、第一轮上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL；第二轮反应体系除引物为第二轮上下游引物和模板为第一轮PCR产物外，其余的试剂种类与剂量与第一轮相同。每轮PCR扩增反应均设置阳性对照和阴性对照。巢氏PCR反应条件：94℃预变5 min；94℃变性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸10 min。第二轮反应较第一轮反应仅退火温度不同，第二轮反应退火温度为58℃。

1.5 电泳与序列测定PCR扩增产物在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳，使用紫外分析仪检测并用凝胶成像系统拍摄。将第二轮结果为阳性的PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，测序仪为ABI PRISM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。

1.6 序列分析利用Clustal X 1.83软件将测得的序列进行比对并参照图谱进行校正，利用BLAST将校正后的序列与NCBI中GenBank数据库的序列进行同源比对分析。为了确定隐孢子虫种类，使用MEGA 6.1的邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育进化树，以Kimura 2-parameter为模型，自展值(Bootstrap)设为1 000，以Plasmodiumcathemerium(GenBank accession number AY625-607)为外群。

1.7 统计学分析利用SPSS 19.0软件中的卡方检验对不同年龄和地区仔猪的隐孢子虫感染率进行统计学分析，当P<0.05时差异显著。

2 结果

2.1 显微镜检结果粪便样品经饱和蔗糖溶液漂浮后直接在显微镜下观察，镜检结果如图1所示，视野中发现隐孢子虫卵囊，4～6 μm，呈圆形、扁圆形和椭圆形，最外层为薄的卵囊壁，内部有呈玫瑰红色的子孢子(图1)。

图1 猪粪便样品中的隐孢子虫卵囊 (400×)

2.2 PCR扩增结果及序列分析基于18S rRNA基因位点的巢式PCR对采集到的375份仔猪粪便样品进行PCR扩增发现，101份粪便样品扩增出约850 bp的片段(图2)，与预期目的片段大小一致。

图2 仔猪隐孢子虫18S rRNA基因扩增结果 M.DL2000 DNA Marker；1.阳性对照；2～5.粪便样品；6.空白对照

2.3 仔猪隐孢子虫感染情况将扩增出目的片段的101份阳性粪便样品按照不同的年龄进行分类(表1)，发现仔猪隐孢子虫平均感染率为26.9%(101/375)，其中断奶前仔猪(<25 d)感染率为13.5%(21/155)，而断奶后仔猪(1～4 月龄)感染率为36.4%(80/220)，统计学分析发现断奶前后仔猪隐孢子虫感染率差异极显著(P<0.001，χ2=24.053)。

表1 陕西省部分地区仔猪隐孢子虫的感染情况及年龄分布

本研究所调查的5个地区规模化猪场的仔猪均存在隐孢子虫感染(表2)，周至、岐山、勉县、临潼、榆阳的感染率分别为57.1%(56/98)，4.3%(3/70)，2.9%(2/70)，24.2%(15/62)，33.3%(25/75)，统计学分析发现5个地区猪场仔猪隐孢子虫感染率差异极显著(P<0.001，χ2=86.108)。

表2 陕西省部分地区仔猪隐孢子虫地区分布

2.4 仔猪隐孢子虫的种类鉴定通过对101份隐孢子虫阳性样品进行遗传进化分析发现(图3)，有90个基因序列与数据库中的C.scrofarum位于同一进化分支，4个基因序列与C.suis位于同一进化分支，7个基因序列与C.parvum位于同一进化分支，提示本研究中仔猪存在3种隐孢子虫感染，分别为C.scrofarum、C.suis和C.parvum。

图3 基于18S rRNA基因位点的仔猪隐孢子虫的遗传进化树

本研究检测到的隐孢子虫种在不同年龄段仔猪中的感染情况如表3所示，其中C.suis仅存在于断奶后仔猪(1～4月龄)，C.parvum只存在于断奶前仔猪(<25 d)，而C.scrofarum同时存在于断奶前后仔猪，且在断奶后仔猪的感染率高。

表3 隐孢子虫在不同年龄仔猪中的感染情况

本研究所检测到的隐孢子虫种在不同地区的感染情况如表4所示，C.suis只存在于周至的猪场，C.parvum只存在于榆阳的猪场，而C.scrofarum在5个县区的规模化猪场广泛存在。

表4 隐孢子虫在不同地区仔猪的感染情况

3 讨论

隐孢子虫检测通常依靠形态学检测方法，然而不同种隐孢子虫在形态学上非常相似，很难通过镜检进行种类鉴定[12]。近年来随着分子生物学的发展，PCR、巢氏PCR、实时荧光定量PCR、反转录PCR、环介导等温扩增等技术均已应用于人和动物隐孢子虫感染的检测[13]，相较于传统的形态学方法，分子生物学检测技术更准确、高效和可靠。本研究采用形态学结合分子生物学的方法对陕西省5个地区规模化猪场仔猪的隐孢子虫感染情况进行了研究，发现所调查地区仔猪隐孢子虫感染率为26.9%(101/375)，低于黑龙江省0～8周龄仔猪隐孢子虫的感染率(67.8%，40/59)[14]，也低于日本某猪场0～2月龄仔猪隐孢子虫的感染率(38.3%，46/120)[15]，但略高于越南断奶前后仔猪隐孢子虫感染率(20.8%，118/567)[16]。本研究对陕西省5个地区的研究发现，周至猪场隐孢子虫感染率最高，其次为榆阳和临潼，而岐山和勉县猪场隐孢子虫感染率较低，统计学分析发现5个地区猪场感染率差异极显著。这些差异可能与猪场的饲养管理方式、驱虫药物使用、采样数量以及当地的土壤、水文等因素有关。

本研究发现，断奶后仔猪隐孢子虫感染率大于断奶前仔猪感染率。前人某些关于隐孢子虫感染率与年龄因素相关性的研究发现[6,17-18]，断奶后1～6月龄的仔猪比其他年龄的仔猪更容易感染隐孢子虫，而小于1月龄的仔猪和成年猪的体内很少检出隐孢子虫[14]，GUSELLE等[19]的研究发现仔猪在45.2日龄时容易检出隐孢子虫卵囊。有研究认为断奶仔猪更容易感染隐孢子虫的原因可能是断奶仔猪失去母源免疫力而自身免疫不足[17]，也可能与断奶应激有关[20]。然而，NGUYEN等[16]在越南的研究得出了相反的结论，他们的研究发现断奶前仔猪隐孢子虫感染率(24.7%，67/271)高于断奶后仔猪隐孢子虫感染率(17.2%，51/296)。基于此，断奶因素对隐孢子虫感染的影响需要更进一步的研究。

本研究对仔猪感染的隐孢子虫的种类进行研究发现，这些仔猪存在3种隐孢子虫，分别为C.scrofarum、C.suis和C.parvum，其中C.scrofarum感染率高达89.1%(90/101)，并广泛存在于5个地区的断奶前后仔猪，为该地区仔猪隐孢子虫的优势虫种，这与李文超等[8]对安徽省江北地区隐孢子虫种调查和ZOU等[21]对浙江、广东、云南三省隐孢子虫虫种调查结果相同。进一步研究发现，C.suis仅存在于在周至断奶后仔猪，而C.parvum只存在于榆阳断奶前仔猪，呈现一定的地区和年龄分布特征。同时，所发现的3种隐孢子虫种类均为人兽共患种类，因此未来需要采集这些猪场人员的粪便样品以评估其人兽共患风险。

综上所述，陕西省部分地区仔猪隐孢子虫感染较为普遍，且检测到了人兽共患C.scrofarum、C.suis和C.parvum，并以C.scrofarum为优势虫种，研究结果对陕西省乃至其他地区仔猪隐孢子虫病的防控提供了基础数据。