三阴性乳腺癌的免疫治疗新策略探讨

李湘奇 魏昌然 张 萌

乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤之一，我国的发生率占全世界的12.2%，病死率占9.6%，近年来乳腺癌发生率在全球范围内增长速度均呈加快的趋势[1]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC) 是乳腺癌中的一个特殊分子亚型，免疫表型为乳腺癌组织中人表皮生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor-2，HER-2)、雌激素受体(estrogen recep-tor,ER) 、孕激素受体(progesterone receptor,PR) 均为阴性表达，分子分型中主要表达为Basal-like型，在所有乳腺癌中约占15%～20% ，由于组织学分级高，容易发生远处转移，是乳腺癌中预后最差、病死率最高的一个亚型。TNBC对内分泌药物治疗基本无效，目前亦无可利用的分子靶向药物，其预后差、病死率高的现状还无法得到进一步的改善[2]。因此，探讨三阴性乳腺癌有效的治疗手段有非常重要的临床意义，找寻特异性的治疗靶点也是临床必须解决的问题。

乳腺癌的发生与发展转移是肿瘤细胞与肿瘤所处的微环境相互作用导致，其中不仅涉及抑癌或癌基因的突变，还涉及肿瘤细胞本身、免疫细胞、细胞外的基质成分、肿瘤新生支持血管等共同构成的抑制免疫微环境的变化[3]。免疫治疗是肿瘤治疗的新兴模式，是继乳腺癌的手术切除、放化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗后的又一治疗模式，其通过激活、调控自身的免疫系统，发挥肿瘤微环境免疫能力，消灭肿瘤细胞、抑制肿瘤的生长和转移。乳腺癌的免疫治疗有很高的特异性，对正常的细胞损伤小，优势在于激发机体产生免疫记忆，临床治疗研究中已经取得了一定疗效，因此有望成为乳腺癌特别是TNBC治疗新的发展趋势。

一、三阴性乳腺癌的免疫治疗优势

TNBC是乳腺癌中一个特殊的分子亚型，相对于Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型的乳腺癌，其生物学特征具有分化程度较差且基因不稳定性的特征。TNBC在细胞毒性药物为主的化学治疗过程中，因为免疫逃逸机制和化疗抵抗，部分尚处于未休眠状态的癌细胞容易复发或发生远处转移，这对患者的预后产生了严重的不良影响。由于TNBC肿瘤的高度异质性和有选择的基因位点的突变，本身更具有抗原性，并可以有效地激活免疫系统。目前临床公认的细胞毒性疗法是化疗，细胞毒性药物可以刺激机体的免疫系统去识别和杀伤肿瘤细胞，从而造成细胞的免疫源性死亡，由此引出了一个适应性免疫反应的概念，但肿瘤的免疫监视原则指出，癌前病变的细胞就能够诱发机体的各种免疫反应，其中很重要的反应是免疫逃逸机制，因为组织相容抗原(major histocompatibility complex，MHC)的存在以及其特殊的抗原递呈机制，致使癌细胞能够逃避免疫系统的杀伤而继续存活[4]。

我国三阴性乳腺癌的女性相对年轻，多见于绝经前的女性，特别是处于T1期乳腺癌，早期即有淋巴结转移，手术后3年内复发率相对较高，预后差、总体生存率较低。近年来，随着曲妥单抗、帕妥珠单抗等分子靶向药物、内分泌药物、低分子TKI类药物的广泛应用，HER-2阳性的乳腺癌和激素受体(HR)阳性的乳腺癌患者病死率已有明显下降的趋势，而分子靶向药物及内分泌治疗药物对TNBC均不敏感，所以在乳腺癌治疗规范和指南中，仍然将化疗作为手术后TNBC的主要辅助治疗方式，但全身辅助化疗，仅对一部分化疗敏感的TNBC患者获益，3年后的复发转移仍居高不下。免疫治疗可能成为TNBC的优势治疗模式，即应用各种方法激活或增强免疫功能，特异性识别肿瘤细胞，并将其清除或杀灭而达到目的。从理论上讲，机体的免疫功能或乳腺癌微环境中的免疫应答激活后，能够特异性地识别杀灭癌细胞，抑制乳腺癌细胞的增殖及转移。由于TNBC的进程中，发生、发展、复发转移与肿瘤所处的微环境免疫状态有着密切关系，因此提高机体的免疫能力，增强激活免疫应答功能可能成为免疫治疗TNBC的主要方向[5]。

二、三阴性乳腺癌的免疫治疗方法

乳腺癌免疫治疗有两种形式，即主动免疫和被动免疫。前者是通过应用免疫原性的疫苗，针对肿瘤抗原使乳腺癌患者产生抗肿瘤免疫应答而达到治疗目的。如树突状细胞(dendritic cell，DC)疫苗、病毒载体疫苗、多肽疫苗等都是临床常用的免疫原性疫苗[6～8]。主动免疫在乳腺癌的治疗主要针对HER-2过表达的患者。被动免疫是将外源性免疫效应物质导入机体，产生免疫反应达到抗肿瘤的作用。常用的免疫效应物质有HER-2、MUC1 单克隆抗体、PD-L1 抑制剂、细胞因子 (干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等)、过继细胞免疫疗法等[9]。

目前针对TNBC免疫治疗方式主要是肿瘤疫苗治疗、免疫检查点阻断、过继性免疫细胞疗法、非特异性免疫调节剂等。肿瘤疫苗治疗如使用特异性高表达于TNBC肿瘤细胞的黑色素瘤抗原3(melanoma-associated antigens 3，MAGEA-3)、以癌-睾丸抗原的主要成分NY-ESO-1为肿瘤疫苗，通过触发体液免疫、细胞免疫应答，促使机体的免疫能力提高，降低肿瘤的负荷，在TNBC免疫治疗中可望成为新靶点[10，11]。一项应用了个性化肽疫苗接种(personalized peptide vaccination，PPV)治疗复发的三阴性乳腺癌的临床研究结果，大部分患者产生了完全性免疫应答，另一部分产生了非完全性免疫应答，证明了PPV对TNBC有一定的疗效[12]。作为专职抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)树突状细胞疫苗，输注到患者体内，可诱导细胞毒T细胞的增殖，并将肿瘤抗原递呈给T细胞，引起强烈的免疫应答，成为TNBC免疫治疗新的契机[13]。

免疫系统具有强大的监视功能，大量的免疫原性靶点能够被识别，然而肿瘤的发展过程会导致各种信号通路的失调，使免疫系统识别肿瘤失活，肿瘤通过适应性免疫保护自己，能够介导这些信号的细胞因子(受体或配体)被称作“免疫检查点”， 这些细胞因子在肿瘤的微环境中均呈现高表达状态，对T细胞的激活起抑制作用，从而使肿瘤细胞逃避免疫杀伤。一旦免疫检查点被阻断后，T细胞将重新激活，解除了肿瘤免疫抑制，修复T细胞对肿瘤细胞的免疫应答。目前研究最透彻、应用最广泛的免疫检查点抑制剂有程序性死亡受体1(PD-1)及其配体PD-L1的抑制剂和靶向细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)[14]。小鼠乳腺癌模型研究发现，丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)的抑制剂在体内外均能提升三阴性乳腺癌细胞MHC和 PD-L1的表达，应用MEK 和 PD-1/PD-L1 混合抑制剂显著提升TNBC模型小鼠的抗肿瘤免疫反应[15]。临床研究对TNBC组织 PD-L1 表达的患者静脉注射PD-1单抗 Pembrolizumab，结果显示有良好的抗肿瘤活性和安全性[16]。目前针对免疫检查点PD-1/PD-L1 抑制剂的免疫疗法已经应用于乳腺癌尤其是 TNBC 的治疗，有效地改善了患者的预后。

特别值得关注的是，TNBC过继性免疫疗法是将抗肿瘤活性细胞的前体细胞经过特异性体外扩增，然后输注给免疫功能低下肿瘤患者达到治疗目的。目前在乳腺癌的研究中对肿瘤杀伤活性有很强作用的是细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)，多种实体瘤采用CIK治疗都取得了显著的疗效[17]。TNBC加用CIK 辅助治疗，与传统放化疗比较，患者的无病生存期(disease-free survival，DFS)和总生存期(overall survival，OS)均获得了显著的延长[18]。

在个体化治疗与精准治疗的理念下，免疫治疗相对于化疗、靶向治疗来说，研究还不够成熟，但是随着各种生物技术的发展，乳腺癌免疫疗法将逐渐被临床认识和广泛应用。而TNBC在缺少特异性的靶向药物及对化疗耐药的情况下，免疫疗法的兴起及应用，必将为患者争取了更长的生存时间和优质的生活质量。

三、 三阴性乳腺癌的T淋巴细胞免疫治疗

T淋巴细胞在胸腺内发育成熟，由于细胞抗原受体(T cell receper，TCR)的结构不同，可以分为 αβT和 γδT细胞两大类细胞系，根据功能分为辅助性T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(CTL)和调节性T细胞(Tr)。αβT细胞又分为CD4+T、CD8+T细胞，CD4+T细胞识别抗原是MHCⅡ类分子限制性，经过活化后主要分化为Th，CD8+T细胞识别抗原是MHCⅠ类分子限制性，活化后主要分化为CTL。人外周血中αβT细胞占T细胞总数的95%以上，其余占1%～5%的是γδT细胞。这两类细胞由于TCR结构的差异，导致了细胞免疫功能和在免疫应答反应中的机制差异，αβT细胞主要是参与机体的免疫监视和免疫防御，γδT细胞由于数目较少，效应细胞是CTL，识别抗原也没有MHC限制性，抗原识别受体也缺乏多样性，只识别多种病原体表达的共同抗原，所以对维持机体的正常免疫功能起到独特的作用。

研究发现，在乳腺癌组织的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)中，绝大部分是T淋巴细胞，其次是B淋巴细胞，还有少量的单核细胞和自然杀伤细胞。TILs中部分具有免疫激活效应或抑制效应的CD4+T细胞，由Th 细胞组成[19,20]。特别是在ER阴性表达的乳腺癌中，CD8+T细胞作为获得性免疫的关键成分，是肿瘤特异性细胞，在肿瘤组织浸润则预后较好，甚至能够达到病理学的完全缓解，而Treg 细胞发挥抗肿瘤的作用，则通过其提升了免疫耐受性状态，表现为乳腺癌新辅助化疗后，肿瘤组织中浸润的 FOXP3+Tregs 数量下降与pCR 率具有显著的相关性[21～23]。三阴性乳腺癌组织中B 淋巴细胞的升高，预示有更好的预后[24]。除此之外，巨噬细胞是血液中的单核细胞分化而成，分别为M1和M2型，M1型巨噬细胞具有抵抗感染、杀伤肿瘤细胞的作用，M2型巨噬细胞能够通过多种机制促进乳腺癌的新生血管生成，增加肿瘤浸润与转移的机会[25]。由此可见，TNBC组织中CD8+T 细胞浸润与其预后密切相关，所以 CD8+T 细胞多用于 TNBC 的过继性免疫治疗或作为肿瘤疫苗应用。如在采用细胞因子诱导杀伤性淋巴细胞免疫治疗的乳腺癌患者中，虽然能够检测到 Treg 细胞短暂的表达升高，但患者体内免疫抑制的状况没有改善[26]。而化疗联合DC-CIK细胞治疗的乳腺癌，患者外周血CD4+、CD4+/CD8+、CD16+CD56+细胞水平均明显升高，CD8+细胞水平显著降低，提示免疫治疗联合化疗能够显著改善机体免疫功能[27]。

现在，有关 TNBC的T细胞免疫治疗的研究还不多，基本处于基础研究阶段，距离临床的应用还有待于验证，还有许多有待解决的问题, 需要更加深层次地探索和临床验证。但我们应该有信心在不久的将来，包括T细胞在内的免疫治疗将会在 TNBC 等恶性肿瘤的治疗中真正成为恶性肿瘤的个性化治疗手段。

四、 γδΤ细胞在三阴性乳腺癌治疗中的作用

γδΤ 细胞是T细胞的一个亚群，其TCR由γ链和δ链组成，通常不表达CD4+和CD8+，他们是识别抗原无MHC限制性的固有T淋巴细胞，关键作用是抵抗感染及肿瘤，具有天然的免疫优势，对恶性肿瘤可产生有效的细胞毒性[28]。外周血γδΤ细胞大部分表达 TCR Vγ9和Vδ2，能杀伤多种肿瘤细胞。在健康的成年人，γδΤ 细胞仅占外周血 T 淋巴细胞的1%～5%，分布范围主要是黏膜和上皮组织，作为机体免疫的重要成分，兼具固有免疫和适应性免疫，作用介于两者之间，在抗肿瘤免疫反应中以其独特的方式识别作用于肿瘤抗原，并通过调节固有免疫和获得性免疫，发挥抗肿瘤的作用。γδΤ细胞所起作用是细胞毒性反应和抗原递呈，只有活化的 γδΤ 细胞才有抗原递呈细胞(APC)的特定的特点和功能。活化后的γδΤ细胞与其他具有免疫功能的细胞相互作用来调节免疫应答，还能够诱导原发性 CD4+和 CD8+T 细胞对抗原的反应，并辅助B淋巴细胞产生IgA、IgM、IgG 抗体，调节体液免疫[29]。

γδΤ 细胞能够通过 MHC 非限制性的方式识别各种恶性肿瘤相关抗原，其对肿瘤细胞的杀伤方式有：①调控 Fas-Fas L通路和相关细胞凋亡因子诱导肿瘤细胞的凋亡；②自身分泌IFN-γ、TNF-α 和 IL-2等细胞因子，对肿瘤细胞以及肿瘤的微环境进行调节，干扰或阻断新生血管的生成，刺激巨噬细胞的增殖，直接或间接抑制肿瘤生长；③通过经抗体依赖的细胞介导发挥其细胞毒性作用，分泌颗粒酶B、穿孔素等生物因子，起到杀伤肿瘤细胞的作用。目前，应用γδΤ细胞抗肿瘤活性的肿瘤免疫治疗有两种途径：①通过体外扩增后再输入到体内的过继免疫输注途径；②体内扩增的途径，即给予机体注射双磷酸盐(nitro-gen-containing B isphosphonates， N-BPs)和IL-2，继而扩增患者体内和肿瘤组织内的γδΤ细胞。γδΤ细胞过继输注亦有两种方式 ：(1)采集肿瘤患者的外周血，删选单个核细胞(PBMC)，分离得到γδΤ细胞，在体外用NBPs和IL-2 培养扩增并活化后，重新回输给患者，利用γδΤ 细胞抗肿瘤活性来治疗肿瘤。(2)采集患者的PBMC，预先分离得到αβT 细胞，在此基础上将TCRγδDNA 转入αβT细胞，使αβT 细胞表达 TCRγδ，再通过体外扩增后回输给患者[30]。采用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)扩增激活γδΤ细胞，也能够迅速获得足量γδΤ的细胞，成为γδΤ细胞的体外扩增的优效途径。

在乳腺癌的免疫治疗中，体外扩增后的过继免疫，尚处于动物实验阶段，临床治疗多采取体内扩增的途径，患者的耐受性好，能够充分促进体内的Vγ9Vδ2T细胞活化成熟。如报道应用唑来磷酸和低剂量IL-2治疗晚期转移性乳腺癌患者的临床研究，观察10例患者的临床结果，认为疗效和外周血中Vγ9Vδ2T细胞的数量显著相关，其中7例患者的外周血中Vγ9Vδ2 T细胞数量下降则病情逐渐恶化，1例达到PR，2例为SD的患者外周血Vγ9Vδ2T细胞数量稳定。肿瘤组织中有无γδΤ 细胞浸润，也被视为预测乳腺癌复发及患者低生存率的一项重要指标，研究者收集了各种临床分期的原发性乳腺癌组织，发现癌组织中γδΤ细胞存在的富集现象，在乳腺癌的新辅助治疗的研究γδΤ细胞的数目与患者的无复发生存、总生存呈负相关，与肿瘤临床分期、HER-2的表达、淋巴结转移呈正相关。所以采用来曲唑联合唑来膦酸的方式体内扩增γδΤ细胞，患者有明显获益。利用γδΤ细胞进行过继免疫治疗TNBC的主要屏障是γδΤ细胞在患者外周血中含量太少，尚无持续可靠的细胞扩增方法。如果能够找到辅助稳定的扩增γδΤ细胞的方法，对乳腺癌的治疗将起到事半功倍的作用。

无论应用体内扩增还是过继免疫的方式，γδΤ细胞抗肿瘤活性的免疫治疗，对乳腺癌等多种恶性肿瘤均取得了令人瞩目的临床疗效。但γδΤ 细胞为基础的免疫疗法仍然有一些尚未解决的问题。因此，深入研究γδΤ 细胞治疗乳腺癌的免疫机制，可能成为未来TNBC的重要免疫治疗手段，具有广阔的临床应用发展前景。

五、展 望

三阴性乳腺癌因其特殊的分子表型，致使临床缺乏更多相应的治疗方法和药物。面对临床TNBC治疗的局限性，特异性高又具有特殊的免疫记忆能力甚至能够提升TNBC生存的免疫治疗，使近几年的治疗局面出现新的转机。目前，针对TNBC的免疫治疗还不够成熟，处于基础研究或实验阶段的研究，还有许多亟待解决的问题，特别是T淋巴细胞参与的免疫治疗更是临床研究应用的短板，需要更加深层次地探索和验证。随着基础理论以及辅助联合免疫治疗TNBC的临床深入研究，在三阴性乳腺癌治疗的领域T淋巴细胞参与的免疫治疗会成为“个体化治疗疗”、“精确医疗”的重要角色。