浸润性乳腺癌中FosB的表达与超声征象及临床病理的相关性

代新珍，米贤军，钟守军，段立锋，杨伟洪，刘祥玉，徐秀梅，黄兆华

（中山市博爱医院病理科，广东中山 528403）

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，也是世界上女性死亡的常见原因，其发病年龄越来越年轻，因此乳腺癌仍是威胁女性健康的最常见恶性肿瘤之一，乳腺癌的早期筛查、诊断、判断预后、个性化治疗仍是目前的研究重点。目前研究表明乳腺癌的形态学表现与分子生物学存在一定的相关性［1］。超声检查目前已经普遍应用于乳腺癌的早期筛查及诊断中，现在越来越多的研究证实乳腺癌超声检查与分子免疫组化之间存在着一定的相关性，通过观察乳腺癌的超声征象可以预测不同分子免疫组化的表达情况及判断预后［2］。乳腺癌是多种基因相互协调作用下发生的，随着分子生物学领域的发展，越来越多的生物标志物被发现在乳腺癌中起着作用。Runx2是一种树突状细胞基因疫苗，在三阴性乳腺癌组织中起着一定的作用，但具体机制尚不清楚，而FosB做为AP家族成员之一，参与乳腺癌的治疗相关机制，可以导致TNBC细胞的死亡，TP4和黄嘌呤类药物等通过促进FosB的表达起到杀伤TNBC肿瘤细胞［3-5］，提示FosB可能在乳腺癌治疗起着作用。然而目前国内外研究对于FosB在浸润性乳腺癌的表达情况及作用机制尚未见报道。本研究通过联合超声检测乳腺癌患者的超声征象及免疫组织化学方法（SP法）检测FosB在浸润性乳腺癌组织中的表达，分析FosB的表达差异与超声征象、组织学分级、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕酮受体（pro⁃gesterone receptor，PR）等临床因素之间的相关性，期望为浸润性乳腺癌个性化靶向治疗及乳腺癌的鉴别诊断、预后判断提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2013年3月至2019年3月于我院手术切除后经我科病理医生证实的155例乳腺浸润性导管癌，36例癌旁组织及30例正常乳腺组织作为对照。乳腺癌患者中位年龄49（28～83）岁；TNM分期Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ期分别有43、112例；组织学分级Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ级分别有107和48例；有淋巴结转移74例，无淋巴结转移81例；乳腺癌患者中术后标本肿物直径≤2 cm的76例，肿物直径＞2 cm的79例。所有患者术前均行超声检查，术后行相关免疫组化检查。患者均是首次住院行肿块切除术，排除术前放疗、化疗及内分泌治疗患者，术前临床资料完整。所有患者均签署知情同意书。本研究经本单位伦理委员会审核同意免伦理审批。

1.2 试 剂

兔单克隆抗体FosB购自abcam及SP试剂盒购自罗氏公司。

1.3 免疫组化SP方法及结果判读

所有乳腺组织标本均常规石蜡包埋，采用SP法染色对FosB、ER、PR、人表皮生长因子受体-2（human epithelial growth factor receptor-2，Her2）等蛋白进行检测，实验步骤严格按照试剂说明书进行。ER、PR、Her2免疫组化结果根据美国临床肿瘤学会标准进行判断，ER、PR棕褐色染色细胞数＞1%为阳性；Her2表达于细胞膜，Her2 FISH检测结果阳性及Her2免疫组织化学结果为3+的判定为Her2阳性，其他为阴性。FosB工作浓度为1：200，定位于细胞核，判断方法为在镜下观察，根据棕色反应的阳性强度及面积判断结果。采用二级积分法：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥75%为4分；染色强度淡黄色为1分，黄或棕黄色为2分，棕褐色或黑色为3分；最后计算两者得分相乘，结果得分大致分布在0～4分与6～12分区间，故本实验以两者得分相乘≥6分判读为阳性。阅片采用双盲法读片。

1.4 荧光原位杂交技术

所有Her2免疫组织化学结果为2+的病理组织都进行Her2荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测，Her2基因扩增检测试剂盒及原位杂交仪ThermoBrite均由广州安必平公司提供，荧光显微镜为Olympus公司产品。

1.5 B超仪器及相关方法

超声检查使用西门子S3000和日立图腾彩色多普勒超声仪，探头频率8～12 MHz。患者行乳腺超声检查，报告描述肿块大小、纵横比、边界、形态、微钙化、彩色血流、淋巴结转移、后方回声衰减等。数据资料均通过超声工作站记录进行回顾性分析。

1.6 统计学处理

全部统计分析用SPSS 19.0完成。两组样本间为分类资料，表1理论数字均大于5，故均采用四格表卡方检验；表2除了纵横比理论数据小于5采用四格表确切概率法外，其他理论数据均大于5，采用四格表卡方检验。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FosB在乳腺组织中的表达

FosB在乳腺组织的表达定位于细胞核，免疫组化染色差异主要在于染色强度及范围的不同（图1）。FosB在正常乳腺组织中染色一般为棕褐色或黑色，染色范围大于50%，在乳腺癌中的染色范围从0到大于75%，染色强度也从无到棕褐色（0～3分）；乳腺部分间质细胞中也可见少许染色为棕褐色。155例浸润性乳腺癌组织中FosB阳性表达率为23.2%（36/155），36例乳腺癌旁组织中FosB阳性表达率为86.1%（31/36），30例乳腺正常组织中FosB阳性表达率为86.7%（26/30），FosB在浸润性导管癌的表达水平明显低于癌旁组织及正常乳腺组织中的表达，差异有统计学意义（P=0.000，表1）。

2.2 FosB的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

FosB在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率为23.2%（36/155），在ER阳性与阴性之间（阳性表达率分别是29.2%、7.1%，P=0.004），在PR阳性与阴性之间（阳性表达率分别是33.7%、6.7%，P=0.000），在组织学Ⅰ-Ⅱ级与Ⅲ级之间（阳性表达率分别是28.0%、12.5%，P=0.034），差异有统计学意义（P＜0.05）；在肿瘤直径≤2 cm与＞2 cm之间（阳性表达率分别是21.1%、25.3%，P=0.530），在患者年龄≤50岁与＞50岁之间（阳性表达率分别是23.2%、23.2%，P=0.998），在腋窝淋巴结转移与无转移之间（阳性表达率分别是27.0%、19.8%，P=0.284），肿瘤TNM分期中Ⅰ期与Ⅱ-Ⅲ期之间（阳性表达率分别是18.6%、25.0%，P=0.399，在Her2阳性与阴性之间（阳性表达率分别是15.9%、26.1%，P=0.174），差异均无统计学意义（P＞0.05；表1）。

图1 FosB在不同的乳腺组织中有代表性的染色情况Fig.1 Representative immunohistochemicai staining of FosB in different breast tissues

表1 FosB蛋白在不同的乳腺组织中的表达情况及与临床病理指标的关系Table 1 The expression of FosB in different breast tissues and its clinical significance［n（%）］

2.3 FosB在乳腺浸润性导管癌中的表达与超声征象关系

浸润性乳腺癌组织中FosB的表达在不同超声征象组：肿块大小、纵横比、形态、边界、后方回声衰减及彩色血流之间无统计学差异（P＜0.05）；FosB在超声显示存在微钙化或腋窝淋巴结增大的浸润性乳腺癌组织中高表达，差异有统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 FosB在乳腺癌组织中的表达与超声征象的相关性Table 2 The expression of FosB in breast cancer is correlated with ultrasonographic features［n（%）］

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病年龄越来越年轻化，严重威胁了女性生命和影响了女性生活质量。虽然目前手术加上化疗帮助很大一部分患者减轻症状，提高了患者生存率，但效果都不是很满意，仍然有一部分患者死于乳腺癌。因此，寻找新的治疗方法和预后指标仍然是乳腺癌目前研究的热点问题。乳腺癌的发病的相关分子机制尚未明确，其发生、发展是一系列基因渐进性累积过程，随着分子生物学领域的发展，越来越多的生物标志物被发现，为其预后判断、治疗方案的选择提供了更全面的依据。

近年来随着对AP-1家族成员研究的深入，发现其参与多种肿瘤的发生、凋亡和转移等生物学过程。而FosB［6-7］作为AP-1家族成员中重要的一员，FosB参与肿瘤的增殖、凋亡及转移，在肿瘤的发生发展过程中充当重要角色。国外目前研究比较多的是FosB在神经元细胞及大脑组织中的作用［8］，有研究［9-12］也发现FosB在间充质细胞增生、骨组织分化、肺癌、卵巢癌以及胃癌中均发挥着重要作用。Hung等［13］则发现在假肌源性血管内皮瘤，FosB还可以做为一个诊断指标，有助于与其他上皮样肉瘤及血管肿瘤的鉴别诊断。以上文献显示FosB通过各种调控机制在各种恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，然而目前国内外对于FosB在浸润性乳腺癌中的表达及相关作用研究比较少见。有研究［14-15］通过蛋白质交互作用和基因交互作用网络预测到FosB在乳腺癌发生发展中起着重要作用。Gao等［16］则认为FosB做为AP家族成员中的一员，在乳腺癌组织分化等中起着重要的调节作用。本研究通过免疫组化检测FosB在浸润性乳腺癌、癌旁组织及正常乳腺组织中的表达，发现在浸润性乳腺癌中FosB的表达水平明显低于癌旁组织及正常乳腺组织中（阳性表达率分别是23.2%、86.1%、86.7%），差异有统计学意义，提示FosB有助于维持乳腺组织正常生长，FosB表达缺失促进肿瘤的发生。Li等［17］发现FosB在乳腺癌组织中的表达明显低于在血液中的表达；Milde-Langosch等［18］则提出FosB是乳腺上皮细胞正常增殖和分化所必须的，FosB表达降低可以使乳腺上皮去分化而导致乳腺肿瘤的产生，上述结果与这些文献报道是一致的。本研究通过免疫组化检测FosB在浸润性乳腺癌不同分化组织中的表达水平，也发现了FosB在浸润性乳腺癌组织学Ⅰ-Ⅱ级（高-中分化）中的阳性表达水平明显高于组织学Ⅲ级组（低分化），差异有统计学意义，提示了FosB的表达与肿瘤恶性程度有关，随着恶性等级增高，其阳性率逐渐降低，乳腺癌组织中FosB高表达的细胞分化往往较好，恶性程度低，预后较好，FosB低表达的细胞分化较差，恶性程度较高，预后差，这些结果与Milde-Lan⁃gosch等［18］提出的FosB在分化差的浸润性乳腺癌的表达水平较低的观点是一致的。本研究结果还发现FosB在浸润性乳腺癌ER+、PR+组织中的表达水平明显高于ER-、PR-组织中（阳性表达率分别是29.2%、33.7%与7.1%、6.7%），差异有统计学意义，提示FosB在浸润性乳腺癌中的表达水平与ER、PR阳性正相关，Bamberger等［19-20］研究发现FosB在乳腺癌细胞中的表达与雌激素受体即ER的表达正相关；Bamberger等［21］提出FosB在乳腺癌组织中的表达水平与PR的两种亚型PR-A和PR-B密切正相关，特别是与PR-B的表达水平，这些文献报道与本研究结果是一致的。有研究［3-5］提出FosB导致TNBC细胞的死亡，TP4、蒽环类药物等通过促进FosB的表达起到杀伤TNBC肿瘤细胞，FosB参与乳腺癌治疗过程，而本研究发现FosB在浸润性乳腺癌ER/PR阳性的患者中高表达，有望为这类患者个性化治疗提供新的研究方向。本研究的其他结果发现FosB在乳腺癌中的表达与肿物直径大小、年龄、淋巴结转移、HER2及临床分期无关，目前国内外对FosB这些方面的作用尚未见明确报道。

Jin等［22］认为serpinB在乳腺癌中起着促进肿瘤淋巴结转移，降低生存率的作用，而在三阴性型乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中FosB可以负向调控serpinB的表达，预测FosB可能可以通过抑制serpinB的表达进而抑制三阴性型乳腺癌的转移，并提高患者生存率，本研究结果提示FosB的表达与淋巴结转移、临床分期无明显相关，与文献预测存在一些差异。这些差异可能与FosB一大特点有关即为FosB是Fos家族成员之一，而在体内Fos家族成员只能和Jun家族成员形成异二聚体；进而激活或抑制多种靶基因的表达，调控细胞的增殖、分化和凋亡，Fos家族和Jun家族成员中的各个基因作用不一致，例如JunD可以通过激活乳腺癌标志物LY6K的表达进而促进乳腺癌转移，降低生存率［23］，与FosB的作用相反，故在乳腺癌患者体内存在的这些蛋白之间交互作用最终导致的结果和体外细胞系中FosB单独作用的结果不一致。并且Kong等［23］的研究是在体外细胞系MDA-MB-231中进行预测的，并未直接检测FosB对乳腺癌患者淋巴结转移及患者生存率的影响，也未对其他亚型细胞系中FosB的作用进行预测，故文献报道暂时具有局限性。目前关于FosB在浸润性乳腺癌患者中对淋巴结转移及患者生存率的影响及相关作用机制有待后期进一步研究。

超声检查目前已经普遍应用于乳腺癌的诊断中，而分子免疫组化指标是决定乳腺癌病理形态学改变的重要因素之一，随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子免疫组化指标被发现与乳腺癌形态学改变密切相关，因而利用超声诊断技术可以预测乳腺癌组织中某些分子免疫组化指标的表达，对在临床中预测预后、指导治疗方案等方面起着重要作用。本研究通过回顾性分析乳腺癌超声征象及免疫组化检测FosB在乳腺癌患者中的表达，分析其相关性，发现FosB的表达与肿块大小、纵横比、形态、边界、后方回声衰减及彩色血流之间无统计学差异；FosB在超声显示存在微钙化或腋窝淋巴结增大的浸润性乳腺癌组织中高表达，差异有统计学意义。本研究这一结果表明了在术前超声显示微钙化多的乳腺癌患者意味着FosB高表达，而本研究上述免疫组化结果已表明FosB的表达与ER、PR正相关，故术前超声显示微钙化提示着FosB、ER、PR的高表达，这一结果与孟令玉等［24］提到的微钙化在Luminal A型（ER/PR强表达）组织中多见是一致的。FosB在超声显示腋窝淋巴结增大的浸润性乳腺癌组织中高表达，与免疫组化检测显示FosB在腋窝淋巴结转移的组织中高表达结果不一致，可能是因为超声显示的腋窝淋巴结转移仅仅是从淋巴结大小来说的，并不都是发生了癌转移的淋巴结，仅仅是提示转移的可能性，故对手术后病理结果显示有癌转移的组织进行免疫组化检测FosB的表达更能代表FosB在乳腺癌中的作用，FosB在乳腺癌淋巴结组织中低表达是预后较好的指标。联合超声与FosB能够更加明确的判读浸润性乳腺癌的恶性程度。乳癌超声特征与FosB的表达具有相关性，两者结合对于判断浸润性乳腺癌的恶性程度及预后更有价值。

综上所述，FosB在乳腺癌中的阳性表达率为23.2%，明显低于癌旁组织及正常乳腺组织，联合检测FosB在乳腺组织中的表达情况，有利于乳腺癌的鉴别诊断。FosB在乳腺癌组织中的差异表达与ER、PR密切相关，有望为ER、PR高表达的患者个性化治疗研究提供一定的方向。FosB在乳腺癌组织中的差异表达还与组织学分级、微钙化、腋窝淋巴结存在一定的相关性，联合超声与FosB能够更加明确的判读浸润性乳腺癌的恶性程度。

本研究衷心感谢陈昂副主任医师审核统计方法；衷心感谢陈志强副主任技师帮忙指导切片及染色。