口腔鳞状细胞癌中Tip60（KAT5）的表达及其相关性分析

郅 程，袁忠民，赖妙玲，廖德贵，郝卓芳，张新华

（广州医科大学附属第二医院 1.病理科，2.神经科学研究所，3.口腔科，广东 广州 510260）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是发生于口腔的恶性肿瘤，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，约占口腔恶性肿瘤的90%［1］。到目前为止，口腔的恶性肿瘤在亚洲国家普遍存在，发病率仍在上升。OSCC具有浸润性生长和局部转移等特点，高复发率，预后差，常在晚期才被诊断［2-3］。虽然手术切除联合放疗、新辅助化疗、靶向生物治疗等在诊断和临床治疗方面取得了巨大进展，但总体OSCC患者生存率仍略有提高，3年生存率为50%～75%，5年生存率约为50%［4］。因此，为提高OSCC患者的预后和生存率，寻找合适的预后或转移性生物标志物和治疗策略势在必行。Tip60（KAT5）属于组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）的MYST家族。在许多细胞事件中发挥作用，包括染色质重构、DNA修复、基因转录、凋亡和肿瘤发生［5］。Tip60（KAT5）在肿瘤发生中起着重要的作用［6-12］。在OSCC组织中，是否存在Tip60（KAT5）表达不同而促进或抑制肿瘤发生和发展，尚未见报道。本研究通过采用免疫组织化学法检测OSCC中Tip60（KAT5）蛋白的表达情况，分析其与患者临床特征之间的关系，并通过MTT技术检测Tip60（KAT5）抑制剂Nu9056对OSCC细胞株Cal27及UM1细胞凋亡的影响，从而为进一步探讨Tip60（KAT5）在OSCC中的调控作用和分子机制做准备。

1 材料与方法

1.1 材 料

收集2015年4月至2018年12月广州医科大学附属第二医院病理科存档的口腔鳞状细胞癌石蜡包埋标本，患者术前均未接受放疗或化疗，均知情同意。样本情况如下：高分化鳞状细胞癌30例、中分化鳞状细胞癌7例、低分化鳞状细胞癌12例及36例口腔鳞状细胞癌癌旁正常组织，鳞状细胞癌组织学分化程度依据人民卫生出版社出版的《病理学》［13］。本研究得到医院医学伦理会审核批准。鳞状细胞癌的临床病理特征见表1。

人口腔鳞癌细胞株Cal27及UM1购自上海细胞生物学研究所中国科学院细胞库。胎牛血清、0.25%胰酶购于Gbico公司。培养基高糖DMEM购于Invitrogen。Tip60（KAT5）抑制剂Nu9056购自Selleck。Anti-Tip60（clone 3F9）购于GeneTex。

1.2 方 法

1.2.1 免疫组织化学染色及评判标准 所有石蜡包埋病理标本均经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，光镜下观察。采用Envision法进行免疫组织化学染色。切片厚度为4 μm，经脱蜡水化；Tris-EDTA修复液高压修复；3%H2O210 min，阻断过氧化物酶；PBS冲洗，滴加一抗Tip60（KAT5）（GeneTex，3F9），放入37℃水浴箱孵育60 min；PBS冲洗后按照采用Envision检测试剂盒（DAKO公司）说明书进行，室温孵育30 min；再次PBS冲洗，DAB显色；苏木精复染，然后脱水、透明、封片。按照抗体说明书分别用膀胱组织及肺癌组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。每例均设阳性对照及阴性对照。

免疫组化结果半定量判定：染色程度为基本不着色为0分；着色呈淡黄色为1分；着色呈黄色为2分；着色呈棕褐色为3分。染色阳性细胞百分比计数，计算阳性肿瘤细胞占总肿瘤细胞的比例，将其分为5个等级：着色阳性细胞占计数细胞≤5%为0分（-），6%～25%为1分（+），26%～50%为2分（++），51%～75%为3分（+++），≥76%为4分（++++）。将染色程度分级与染色细胞百分比相乘，乘积=0为阴性，乘积≤4分为低表达，5≤乘积≤8分为中表达，9≤乘积≤12分为高表达［14］。

1.2.2 细胞培养 将Cal27及Um1置于体积分数10%胎牛血清、高糖DMEM液体培养液，37℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下培养，每3～5 d用胰酶消化传代1次。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 MTT比色法检测Tip60（KAT）抑制剂Nu9056对Cal27及Um1细胞增殖的影响 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，铺96孔板，每组设6个复孔，每孔加入100 μL细悬液；体积分数5%CO2，37 ℃孵育24 h后，换含有溶剂、不同浓度Nu9056（5、10及20 μmol/L）的培养基，作用24 h或换含有溶剂、Nu9056（5 μmol/L及10 μmol/L）的培养基，每组在培养24、48和72 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。计算公式：细胞增殖率=（各加药组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，加入DMSO作为溶剂对照组。

1.3 统计学分析

用SPSS 20.0统计分析软件包进行数据处理。多组间Tip60（KAT5）表达率的比较用多个样本率的χ2检验。Cal27及UM1细胞各组MTT检测数据以平均值± 标准差（）表示，多样本间比较采用单因素方差分析one-way ANOVA；随后的组间比较采用LSD法。相关性分析采用Spearman等级相关分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Tip60（KAT5）在口腔鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的表达

Tip60（KAT5）阳性表达表现为细胞核内见棕黄色颗粒（图1A～H）。36例口腔鳞状细胞癌及其癌旁正常组织中，鳞状细胞癌Tip60（KAT5）高表达率66.67%，癌旁正常组织Tip60（KAT5）高表达率8.33%，差异有统计学意义（χ2=58.062，P=0.000；表1，图1I）。

表1 OSCC及癌旁正常组织中Tip60（KAT5）表达情况Table 1 Tip60/KAT5 expression in OSCC and normal tissue adjacent to OSCC（n）

2.2 Tip60（KAT5）表达与临床病理特征关系

图1 免疫组织化学法检测不同分化程度OSCC及癌旁正常组织中Tip60（KAT5）的表达Fig.1 Tip60（KAT5）expression in OSCC and normal tissue adjacent to OSCC was detected by immunohistochemical analysis

Tip60（KAT5）表达与患者肿瘤分化程度相关。与高分化鳞状细胞癌相比，中-低分化鳞状细胞癌中Tip60（KAT5）的表达明显增高（χ2=10.432，P=0.001；图1J，表2）；随着组织学级别的升高，Tip60（KAT5）的表达增高，其表达强度与组织学级别呈明显正相关（r=0.461，P=0.001）。Tip60（KAT5）在不同年龄组间、性别、淋巴结转移及TNM分期无关（表2）。

2.3 Tip60（KAT5）抑 制剂Nu9056对Cal27及UM1细胞株增殖的影响

MTT方法检测抑制剂Nu9056在不同浓度（DMSO、5、10及20 μmol/L）及不同时间（24、48及72 h）作用情况下对Cal27及UM1细胞株增殖的抑制作用，结果显示随着浓度及时间的增加，对Cal27及UM1细胞的增殖抑制率逐渐增加，呈浓度及时间依赖关系。不同浓度及时间之间差异有统计学意义（不同浓度对Cal27及UM1细胞的增殖抑制率比较F=322.13，P=0.000；F=252.76，P=0.000；5 μmol/L及10 μmol/L作用不同时间对Cal27细胞的增殖抑制率比较F=231.29，P=0.000；F=817.85，P=0.000；5 μmol/L及10 μmol/L作用不同时间对UM1细胞的增殖抑制率比较：F=243.40，P=0.000；F=1222.47，P=0.000；图2）。

3 讨论

真核细胞中，蛋白质通过翻译后修饰使其发生活性或功能改变，调控细胞的生长、信息传递及对环境因素刺激的应答反应。其中，赖氨酸乙酰化是改变蛋白质功能最普遍的一种修饰方式之一，可以影响蛋白的酶活性、稳定性、DNA结合能力及蛋白质之间的相互作用等［15］。乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共同调控，其中Tip60（也称为KAT5）属于组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）的MYST家族，依靠其具有的乙酰转移酶活性，乙酰化组蛋白，中和组蛋白上的正电荷，从而降低其与带负电荷的DNA的结合亲和力，从而降低了组蛋白与染色体的亲和力［16-17］。同时，Tip60可以乙酰化其他与转录因子及DNA损伤反应相关蛋白，如Myc、STAT3、NF-B、E2F1、ATM和p53［18-21］。因此Tip60通过多种方式影响肿瘤发生，Tip60的低表达或表达缺失与在晚期结直肠癌［6-7］、胃癌［8］和乳腺癌［9-10］的发生呈负相关，敲除Tip60可促进黑色素瘤和胶质母细胞瘤的迁移和侵袭［11-12］。然而，在前列腺癌中却恰恰相反，Tip60抑制剂Nu9056可抑制前列腺癌细胞的增殖，诱导凋亡［22］。

表2 49例口腔癌组织中Tip60蛋白表达与肿瘤患者临床特征的关系Table 2 Tip60（KAT5）expression and Clinic pathological feature of 49 OSCC（n）

图2 MTT法检测Nu9056对Cal27及UM1细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition rate of proliferation of Cal27 and UM1 cells by Tip60（KAT5）inhibitor Nu9056

本研究基于免疫组织化学的方法，首先探讨了OSCC中Tip60的表达情况，与正常组织相比，OSCC中Tip60的表达明显升高，其高表达率为66.7%，且与分化程度呈正相关，而与直肠癌、胃癌和乳腺癌表达略有不同［7-11］，可能与肿瘤部位及类型有关，同时我们研究发现Tip60抑制剂Nu9056可降低OSCC细胞增殖活性，这一点与前列腺癌研究结果相一致。因此，我们可以得出结论，Tip60蛋白上调与OSCC的发生及进展有关，并且通过抑制Tip60的表达可阻碍OSCC的发展。

以顺铂为代表的铂类化合物由于其显著的抗瘤效应，是治疗口腔鳞状细胞癌最常用的一类化疗药物，然而临床上越来越多的病人对顺铂产生的耐药性。Su及Cregan等团队都发现降低Tip60的表达可以增加细胞对顺铂的敏感性［23-24］。顺铂通过与DNA形成复合体，导致DNA的大量扭曲、双螺旋结构不稳定，从而抑制DNA复制及转录，最终导致肿瘤细胞的死亡。Tip60可以降低DNA修复活性，导致顺铂与DNA复合物增加，从而降低顺铂的耐药性。因此，Tip60及其相关抑制剂为OSCC的铂类化合物化疗寻找新的靶点。