UPLC法同时测定橘核中7种成分含量

刘兴赋，郁林娜，付洋，程盛勇，鲁文琴，罗喜荣，杨军

（1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550025；2.贵州医科大学附属医院，贵州贵阳550004；3.中国科学院地球化学研究所，贵州贵阳550081）

橘核为我国常用中药，系芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟种子，具有理气、散结、止痛等功效[1]。橘核的主要活性成分为柠檬苦素类和黄酮类化合物，具有明显的抗肿瘤、镇痛抗炎、抗氧化、杀虫等药理作用，现代临床常用于治疗急性乳腺炎、乳腺增生等疾病，其药用价值较高[2-8]。橘核目前仍以理化鉴别为质量控制手段，缺少含量测定项，其质量标准尚不完善。依据中药整体成分发挥作用的特点，开展指纹图谱研究和多成分含量测定并建立质量标准，是保障中药质量和疗效一致性的有效方法。本试验基于前期橘核超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatograph，UPLC）指纹图谱研究[9]，首次建立了UPLC 同时测定橘核中柚皮素、橙皮素、柚皮苷、橙皮苷、柠檬苦素、诺米林和黄柏酮含量的方法，为其质量标准的提高和修订提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

柑橘果实收集于贵州、湖南、广西等地，果实摘取种子，洗净后自然阴干，经贵州医科大学生药学教研室覃容贵教授鉴定为芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥种子，见表1。

表1 橘核样品来源Table 1 Citri reticulatae semen samples from different production batches and areas

柚皮素、柚皮苷、黄柏酮对照品：北京索莱宝科技有限公司，批号分别为1112A024，116A022，516A21，纯度均＞98%；橙皮素对照品：北京北纳创联生物技术研究院，批号130429，纯度＞98%；橙皮苷对照品：中国食品药品检定研究院，批号110721-201014，纯度＞95 %；柠檬苦素、诺米林对照品：实验室自制，纯度均＞98%；乙腈（色谱纯）：德国默克公司。

1.1.2 仪器

Agilent 1290 DAD 超高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；BSA224S 型电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；UC-10H 型加热超声波清洗器：上海泰坦科技股份有限公司；TGL-16G 型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；FW177 型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：UItimateRUHPLC Polar-AQ-C18（2.1 nm×100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈-水（45 ∶55，体积比）；梯度洗脱（0～18 min，15%～40%A；18 min～20 min，40%A；20 min～35 min，40%～50%A）；流速：0.21 mL/min；检测波长：283 nm（0～20 min），210 nm（20 min～35 min）；柱温：30 ℃；进样量：0.8 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮对照品适量置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度分别为400、375、112.5、262.5、8 037.5、1 400、1 500 mg/L 的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

准确称取脱脂橘核粉末（过40 目筛）0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声提取（功率 200 W，频率 35 kHz）40 min，放至室温20 ℃，用甲醇补足减失的质量，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 线性关系考察

取“1.2.2”项下混合对照品溶液适量，逐级稀释得系列混合对照品工作溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样检测。以混合对照品溶液中各指标成分的质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，分别绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，计算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的RSD 值。

1.2.7 重复性试验

精密称取同一批次橘核药材6 份，按“1.2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，计算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的RSD 值。

1.2.8 加样回收率试验

精密称取6 份已知含量的橘核药材粉末0.1 g，分别加入混合对照品溶液适量，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，计算柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的平均回收率和RSD 值。

1.2.9 样品测定与数据处理

取表1 样品按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，测定柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的峰面积，以回归方程计算样品中各指标成分的含量。

2 结果与分析

2.1 专属性

取标准品溶液和供试品溶液按“1.2.1”项下条件检测，结果7 种被测成分均能达到基线分离，峰形较好，无杂质峰干扰，色谱图见图1。

2.2 标准曲线

以浓度X（mg/L）为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制标准曲线，得柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的回归方程，结果见表2。

图1 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and sample（B）

表2 7 种成分回归方程及线性范围Table 2 Regression equations with linear range for 7 compounds

2.3 精密度试验

精密度试验结果显示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的RSD 分别为1.74%、1.89%、1.87%、1.28%、1.91%、1.65%、1.55%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

稳定性结果显示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的RSD 分别为1.96%、1.83%、1.93%、1.77%、1.75%、1.97%、1.29%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5 重复性试验

重复性试验结果显示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮峰面积的RSD 分别为1.54%、1.15%、1.68%、1.89%、1.36%、1.79%、1.61%，表明方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

加样回收率试验结果显示，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的平均回收率分别为 102.93 %、108.84 %、109.18 %、106.97 %、102.62 %、103.98 %、103.19 %，RSD 分别为 1.96 %、1.82%、1.45%、1.71%、1.67%、0.86%、1.16%，表明方法准确度良好。

2.7 样品测定

取表1 样品按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，计算样品中各指标成分的含量，结果见表3 和图2。

表3 橘核中7 种成分的含量测定Table 3 Determination of seven components in Citri reticulatae semen %

图2 橘核中7 种成分含量分布Fig.2 Distribution of seven components in Citri reticulatae semen

3 结论

本试验考察了水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、95 %乙醇、无水乙醇等提取溶剂对橘核中7 种成分提取的影响，结果表明甲醇提取效果最佳。采用DAD 检测器对混合对照品溶液和供试品溶液进行紫外全波长扫描，结果发现黄酮类成分的最大吸收波长为283 nm，柠檬苦素类成分吸收峰在210 nm 处响应最高，故采用波长切换法对橘核样品进行检测。

2017 年我国柑橘总产量高达3 816 万吨，品种品系众多，橘核来源丰富[10]。中国药典2015 年版中橘核药材无含量测定方法及限度要求，已不适应橘核的现代应用要求。本研究建立了UPLC 同时测定橘核中柚皮素、橙皮素、柚皮苷、橙皮苷、柠檬苦素、诺米林和黄柏酮含量的方法，该方法简便、准确、专属性强，可用于橘核药材的质量控制及评价。样品测定结果表明16 批不同产地橘核药材中7 种成分含量差异较大，RSD 为32.98%～124.16%，其中柠檬苦素和诺米林分别占总量的65.32%和24.63%，为保证橘核药材的临床疗效，建议橘核中柠檬苦素含量不得少于0.71%、诺米林含量不得少于0.27%、7 种成分含量不得少于1.09%。