响应面优化酶法提取沾化冬枣汁的工艺研究

郝心，卢晓明，乔旭光

（山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

沾化冬枣（Ziziphus jujuba）一般在 10 月～11 月自然成熟，又名“冻枣”。发源于山东滨州沾化区，是公认的品质最好的鲜食枣品种[1]。冬枣营养丰富，富含人体所需的16 种氨基酸[2]和维生素A、维生素B、维生素C等多种维生素，其中维生素C 含量达到245 mg/100 g～327 mg/100 g[3]，有“活维生素丸”之美誉；含蛋白质，膳食纤维及微量元素。冬枣果肉皮薄肉脆，酸甜无渣，口感极好。

国内市场上的冬枣多用来鲜食，而市场上的其他枣产品大多以干枣为原料加工而成，在干燥过程中，枣类的营养物质被破坏[4]。采用干枣酶解后浸提制备枣汁的研究较多[5-8]，而采用鲜枣制备枣汁的研究相对较少[9]。由于冬枣果肉中含有大量的果胶和纤维素，导致冬枣果汁的黏度较大、出汁率较低[10-12]，因此需要加入酶来分解果胶、纤维素，提高出汁率[13-14]。在果蔬加工过程中使用的酶有果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、鼠李糖苷酶、中性蛋白酶等[15]，而最常用的为果胶酶和纤维素酶。

本试验以酶解技术为手段，在单因素试验的基础上进行响应面试验设计，研究酶用量、酶解温度、酶解时间等因素对冬枣汁出汁率和可溶性固形物含量的影响及其交互作用，从而确定了酶法提取冬枣汁的最佳工艺条件，提高冬枣汁的出汁率，为冬枣的深加工利用提供理论研究。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

沾化冬枣：泰安市水果批发市场；果胶酶（酶活50 000 U/g）、纤维素酶（酶活 100 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E/02 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；AR2130/C 电子精密天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；MJ—WBL2521H 料理机：广州美的生活电器制造有限公司；HH-S6 恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；LXJ-IIB 离心机：上海安亭科学仪器厂；WYT-4 手持糖度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冬枣汁的制备

取新鲜的冬枣去核后，加入相同质量的水打浆得到冬枣果浆。称取200 g 冬枣果浆放入250 mL 烧杯中，用保鲜膜将烧杯口密封，防止水分蒸发[16]。将烧杯放入水浴锅内，预热到适宜温度后加入适量的酶进行酶解，酶解结束后迅速灭酶，冷却至25 ℃后于4 000 r/min 离心20 min，收集上清液即为冬枣汁。

1.3.2 酶的种类对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

取200 g 冬枣浆，分别加入0.1%的果胶酶、纤维素酶和复合酶（果胶酶∶纤维素酶质量比为1 ∶1），在50 ℃下酶解60 min，离心取上清液，计算出汁率、测定可溶性固形物含量。

1.3.3 复合酶的添加比例对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

取200 g 冬枣浆，分别加入0.1%不同比例的复合酶（果胶酶∶纤维素酶质量比分别为3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3），在 50 ℃下酶解 60 min，离心取上清液，计算出汁率、测定可溶性固形物含量。

1.3.4 单因素试验设计

1.3.4.1 酶用量对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

固定酶解温度50 ℃、酶解时间60 min，研究不同酶用量（0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响。

1.3.4.2 酶解时间对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

固定酶解温度50 ℃、酶用量0.1%，研究不同酶解时间（0、30、60、90、120 min）对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响。

1.3.4.3 酶解温度对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

固定酶解时间60 min、酶用量0.1%，研究不同酶解时间（35、40、45、50、55、60 ℃）对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以酶用量、酶解时间、酶解温度为响应因子，冬枣的出汁率和可溶性固形物含量为响应值，将自变量分为3 个水平，编码为-1、0、1，采用Design-Expert 8.0.6.1 软件中Box-Behnken 中心组合试验设计三因素三水平响应面分析试验。试验因素及水平设计见表1。

表1 酶解法制备冬枣汁响应面试验设计Table 1 Design of response surface methodology for enzymatic extraction of jujube juice

1.3.6 指标测定

1.3.6.1 出汁率计算

按以下公式计算：

式中：m1为离心后枣汁的质量，g；m2为冬枣浆的质量，g。

1.3.6.2 可溶性固形物含量测定

采用手持糖度计直接测得。

1.3.6.3 数据分析

试验结果采用Origin 8.0 作图。单因素方差分析采用SPSS 17.0 进行，单因素方差分析（ANOVA）字母相同表示无差异显著性（P＞0.05），字母不同代表差异显著（P＜0.05）。采用 Design-Expert 8.0.6.1 软件中 Box-Behnken 中心组合试验设计进行响应面试验。

2 结果与分析

2.1 酶的种类对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

酶的种类对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响见图1。

图1 酶的种类对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响Fig.1 Effect of enzyme species on juice yield and soluble solids content

由图1 可以看出，添加果胶酶和纤维素酶均可显著提高冬枣的出汁率（P＜0.05），这是因为果胶酶可以分解细胞壁中的果胶物质[17-18]，纤维素酶可以降解纤维素、提高细胞壁通透性[19]。但在相同用量的情况下，复合酶的酶解效果比添加单一酶要好，这是由于双酶混合水解有利于提高底物转化率[20]。因此选择复合酶进行酶解。

2.2 酶的添加比例对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

果胶酶与纤维素酶的比例对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响见图2。

由图2 可知，在果胶酶与纤维素酶质量比例为1 ∶1、1 ∶2 可溶性固形物含量的差异显著（p＜0.05），出汁率变化不大；果胶酶与纤维素酶比例为1 ∶3 时可溶性固形物含量最大，但此时出汁率不高；果胶酶和纤维素酶添加比例为1 ∶2 时冬枣的出汁率最高，为72.99%，可溶性固形物含量较高为8.1%。因此选择果胶酶∶纤维素酶=1 ∶2 进行酶解。

图2 果胶酶与纤维素酶的比例对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响Fig.2 Effect of proportion of pectinase and cellulase on juice yield and soluble solids content

2.3 单因素试验

2.3.1 酶用量对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

酶用量对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响见图3。

图3 酶用量对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响Fig.3 Effect of the composite enzyme adding amount on juice yield and soluble solids content

由图3 可以看出，当不添加复合酶时，冬枣的出汁率最低，枣汁黏度大且较为浑浊，可溶性固形物含量高。酶用量在0%～0.1%范围内，随着添加量的增加冬枣出汁率逐渐升高，可溶性固形物含量由8.9%降低至8.1%；当酶用量为0.1%时，冬枣出汁率达到最高，为72.91%，可溶性固形物含量为8.1%；当酶用量为0.1%～0.5%时，冬枣的出汁率变化不显著，可溶性固形物含量变化不显著。因此选择0.1%作为最佳的酶用量。

2.3.2 酶解时间对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

酶解时间对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响见图4。

图4 酶解时间对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on juice yield and soluble solids content

由图4 可以看出，随着酶解时间的延长，冬枣出汁率逐渐增加，可溶性固形物含量逐渐降低。当酶解时间为60 min 时，冬枣出汁率达到最高，为72.84%，可溶性固形物含量为8.13%；当酶解时间继续增加时，出汁率与可溶性固形物含量变化不大，因此选择60 min 作为最佳的酶解时间。

2.3.3 酶解温度对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响

酶解温度对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响见图5。

图5 酶解温度对冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on juice yield and soluble solids content

由图5 可以看出，当温度为35 ℃～50 ℃时，随着温度的升高，出汁率逐渐升高，可溶性固形物含量逐渐下降；当酶解温度为50 ℃时，冬枣出汁率达到最高，为72.77%，可溶性固形物含量为8.17%；当酶解温度继续升高时，温度过高会导致果胶酶与纤维素酶失去活性，酶解效率降低，出汁率减小。因此选择50 ℃作为最佳的酶解温度。

2.4 响应面试验

试验方案及结果见表2。

表2 酶解法制备冬枣汁的响应面试验结果Table 2 Results of response surface methodology for enzymatic extraction of jujube juice

对试验结果进行分析，可得酶用量（%）、酶解时间（min）、酶解温度（℃）与出汁率、可溶性固形物含量之间的回归方程分别为：

出汁率=72.95+1.41A+1.03B+0.053C-0.35AB-0.082AC-0.26BC-0.43A2-2.49B2-4.81C2

可溶性固形物含量=8.16+0.050A+0.13B-0.075AB-0.025AC-0.075BC-0.19A2-0.19B2-0.34C2

采用分析软件回归模型进行方差分析，结果如表3、表 4 所示。

表3 出汁率回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of multiple regression model of juice yield

续表3 出汁率回归模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of multiple regression model of juice yield

表4 可溶性固形物含量回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of multiple regression model of soluble solids content

由表3 的方差分析结果可以看出，所得出汁率的回归模型方程显著，回归模型误差P=0.000 8，达到显著水平，而模型失拟度P=0.314 1＞0.05，说明回归方程的拟合程度较好。其决定系数R2=0.952 0，说明该模型的拟合度好、误差较小，能够较好的反映出各因素对冬枣出汁率的影响。F 值用于评价各因素对试验指标的影响，F 值越大，影响越显著，因此各因素对出汁率的影响顺序为：酶用量＞酶解时间＞酶解温度。

由表4 的方差分析结果可以看出，所得可溶性固形物含量的回归模型方程显著，回归模型误差P=0.001 2，达到显著水平，而模型失拟度P=0.065 5＞0.05，说明回归方程的拟合程度较好，能够对试验进行很好地模拟。其决定系数R2=0.945 8，说明该模型的拟合度较好、误差较小，可以对冬枣汁可溶性固形物含量进行准确的分析和预测。由F 值可知，各种因素对可溶性固形物含量的影响顺序为：酶解时间＞酶用量＞酶解温度。

在响应面图中，对出汁率影响越大的因素，其曲线变化趋势越大。在等高线图中，轴向等高线越密集，说明该因素对出汁率的影响越显著[21]。

两因素交互作用对冬枣出汁率的影响响应面图和等高线图见图6，对可溶性固形物含量的影响响应面图和等高线图见图7。

图6 两因素交互作用对冬枣出汁率的影响响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of crossinteractions among factors on jujube juice yield

图7 两因素交互作用对冬枣可溶性固形物含量的影响响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of crossinteractions among factors on jujube soluble solids

从图6 可以看出，三因素之间均有交互作用。而酶用量与酶解时间之间的交互作用最明显，其次是酶解温度与酶解时间之间的交互作用，而酶用量与酶解温度之间的交互作用最弱。从图7 可以看出，酶用量与酶解温度之间的交互作用最不明显。

2.5 响应面验证试验

利用二次回归模型，得出模型自变量为酶用量0.10%、酶解时间67.96 min、酶解温度49.46 ℃，预测出汁率为72.95%、可溶性固形物含量为8.19%。为了验证回归模型的有效性，考虑到试验的可操作性，选择酶用量0.1%、酶解时间68 min、酶解温度50 ℃为最佳的酶解法提取冬枣汁的最佳工艺条件。在此条件下进行3 组平行试验，试验结果的出汁率为（72.27±0.3）%、可溶性固形物含量为（8.0±0.2）%，与预测值结果接近。

3 结论

加入的果胶酶与纤维素酶一起作用，分解果胶和纤维素类物质，使植物细胞快速释放出细胞内的营养物质，从而提高果蔬的出汁率。本试验探讨了复合酶对沾化冬枣出汁率和可溶性固形物含量的影响，在以后的研究中可以以果汁的黏度、香气成分等为指标进行深入的研究。通过单因素和响应面设计分析回归模型，结果表明，各因素对冬枣出汁率的影响顺序为：酶用量＞酶解时间＞酶解温度，对可溶性固形物含量的的影响顺序为：酶解时间＞酶用量＞酶解温度。根据模型求出最佳的工艺参数为：酶用量0.1 %、酶解时间68 min、酶解温度50 ℃，在此条件下进行验证试验，实验测出出汁率为（72.27±0.3）%、可溶性固形物含量为（8.0±0.2）%，与预测值结果接近。因此，在冬枣汁提取工艺中采用该工艺参数是可行的。