鸡肉中丙酸睾酮残留表面增强拉曼光谱检测条件的优化

王婷，刘木华，袁海超，赵进辉，徐宁，陈健，胡围，宋怡欣

（江西农业大学工学院江西省现代农业装备重点实验室，江西南昌330045）

丙酸睾酮（testosterone propionate，PTS）是一种功效类似于睾酮的甾类同化激素。养殖户在鸡等家禽中使用PTS，以提高食欲、促进生长和增加体脂[1]。经研究表明，含PTS 的鸡肉通过食物链进入人体后，经过消化吸收进而对人体发育产生影响，如儿童早期性发育、诱发癌症、内分泌失调等[2]。中国已经颁布了对禽类禁止使用PTS 的条例，为了保障食品健康安全，必须提供一种快速和高灵敏度的分析方法，找到其检测条件优化结果，便于快速检查市场上鸡肉的安全。

目前，对于PTS 激素残留主要的检测方法包括酶联免疫法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联机法、毛细管电泳法、荧光光谱分析法和拉曼光谱法[3-5]。表面增强拉曼光谱技术（surface-enhanced Raman scattering，SERS）作为一种稳定性强、抗干扰、方便快捷的方法，被广泛应用于医学及生物领域、食品安全和环境检测等领域[6]。近年来，SERS 技术已被应用于家禽体内激素残留检测，如陶进江等[7]使用QE65000 型拉曼光谱仪，对鸭肉中丙酸睾酮、乙烯雌酚、诺龙3 种性激素类药品进行SERS 光谱采集，确定了药品中3 种激素的拉曼特征峰，探究出了不同检测条件的最优量，并建立了鸭肉中性激素残留标准曲线。冯超等[8]使用RM-200 型便携式拉曼光谱仪，对17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚3 种雌激素类药品进行拉曼光谱采集，确定其3 种激素的特征峰并进行了分析对比和模拟计算，结果表明，运用SERS 技术可以快速检测出17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚等三种激素。ZHAO J H 等[9]采用SERS 技术结合化学计量学方法，运用自适应迭代加权惩罚最小二乘法和最小二乘支持向量机对猪肉中克莱多巴胺和盐酸克伦特罗残留进行快速检测和识别。LIN S C 等[10]采用SERS 技术快速、简单的检测违禁鱼类药物-结晶紫和孔雀石绿，显示了SERS 技术在违禁鱼类药物快速筛选中的应用潜力。到目前为止，还未发现以鸡肉中PTS 为研究对象，对鸡肉中PTS残留检测条件进行优化分析的研究。本研究内容运用SERS 技术对鸡肉中PTS 残留的检测条件（金胶加入量、含PTS 的鸡肉提取液加入量、硫酸镁溶液加入量以及反应时间）进行优化分析，对检测禽肉中PTS 残留快速检测的实现具有一定的研究意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡：江西农业大学农贸市场；PTS 标准品（纯度约为99%）：南昌精科科学仪器有限公司；四氯金酸（其中金含量≥49%）：西格玛奥德里奇贸易有限公司；无水乙醇、乙腈、正乙烷、柠檬酸三钠、硫酸镁（均为分析纯）：南昌精科科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

拉曼光谱仪（QE65000 型）：美国海洋光学公司；电子天平（FA1004B 型）：上海上平仪器有限公司；高速组织匀浆机（DS-1 型）：上海标本模型厂；漩涡振荡器（VORTEX-5 型）：江苏海门市其林贝尔仪器有限公司；低速离心机（JW-1024）：安徽嘉文仪器装备有限公司；氮吹仪（HSC-24B）：天津市恒奥科技发展有限公司；新世纪紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限公司；万用电磁炉（DK-98-‖）：北京科技永兴仪器有限公司；实验室全自动RO 纯水机：美国Teledyne 水质公司；超声波清洗器（JK-50B 型）：合肥金尼克机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 PTS 标准溶液的制备

称取10 mg 的PTS 标准品，用少量甲醇溶于100 mL棕色容量瓶中，超声溶解后冷却至25 ℃，再用甲醇定容至刻度，得到100 mg/L 的标准溶液。

1.3.2 空白鸡肉提取液制备

称取5 g 匀浆鸡肉放入50 mL 离心管中，加入20 mL乙腈，经涡旋 1 min，超声振荡 10 min，4 200 r/min 离心10 min，残渣用乙腈重复萃取一次。合并上清液，加入2 g 无水硫酸钠，涡旋1 min，在60 ℃下氮气吹至约10 mL 溶液，4 200 r/min 离心 10 min，取出液体过滤后，加入10 mL 正己烷，经涡旋1 min，超声振荡10 min，离心4 200 r/min，10 min 后取下层乙腈相，在30 ℃下氮吹至近干，加入适量甲醇定容至20 mL 处，得到本研究的空白鸡肉提取液。

1.3.3 含PTS 鸡肉提取液制备

称取约10 mg PTS 标准品放入100 mL 棕色容量瓶中，加入少量的空白鸡肉提取液，超声溶解冷却至25 ℃，再用空白鸡肉提取液定容，得到含100 mg/L PTS的鸡肉提取液。

1.3.4 金胶的制备

100 mL 0.01%氯金酸加入到200 mL 烧杯中，放至万用电磁炉上加热至沸腾后，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠溶液，并不停搅拌9 min，冷却至25 ℃后备用[11]。

1.3.5 样本的采集

1）样本的拉曼光谱采集：先后取不同量的金胶（0、200、300、500、700、900 μL）、不同量的含 PTS 的鸡肉提取液（0、3、5、10、15、20 μL）及不同量的硫酸镁溶液（0、30、50、70、100、120、150 μL）充分混合，置于 2 mL 石英瓶中经不同反应时间大小（0、1、5、10、15、20 min）后，放于拉曼仪器样品池中进行拉曼光谱采集。

2）样本的可见-紫外采集方法：对纳米金胶、纳米金胶＋含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）＋硫酸镁溶液两种溶液用水进行稀释，用紫外可见分光光度计对稀释后的溶液样本进行可见-紫外信息采集。

1.4 SERS检测条件优化方案

为了获取更加灵敏的SERS 信号，同时探究出各种不同检测条件对SERS 光谱强度的影响，关键是确定检测条件优化方案：1）反应时间：首先来确定最优反应时间，以 500 μL 纳米金胶加入量，加入 5 μL 含 PTS的鸡肉提取液（8 mg/L），再加入 120 μL 硫酸镁溶液，经反应时间 0、1、5、10、15、20 min 后，采集其拉曼光谱并对比每个时间点所对应的SERS 光谱图，确定最优反应时间。2）纳米金胶的加入量：将金胶加入量分为6种（0、200、300、500、700、900 μL），每种金胶与 5 μL含 PTS 鸡肉提取液（8 mg/L）、120 μL 硫酸镁溶液充分混合，采集其拉曼光谱并观察其SERS 光谱图。3）待测溶液的加入量：确定了金胶的加入量后，以金胶加入量和硫酸镁固定值，改变含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）的体积（0、3、5、10、15、20 μL）来确定含 PTS 的鸡肉提取液最优加入量。4）硫酸镁加入量：以上确定了反应时间、金胶加入量、待测溶液加入量的最优条件，比较硫酸镁溶液（0、30、50、70、100、120、150 μL）加入不同体积下的SERS 光谱，找到硫酸镁溶液最优加入量。所有试验平行检测5 次。

1.5 数据处理方法

1.5.1 拉曼光谱仪预处理

对QE65000 型拉曼光谱仪参数设置：激光器功率为650 mW，激光波长785 nm，并选取扫描光谱波段为400 cm-1～1 800 cm-1范围进行研究，分辨率 6 cm-1，积分时间10 s，积分平均2 次，平滑度为1。

1.5.2 对检测条件定性分析数据处理方法

将不同检测条件下的样本溶液放入QE65000 型拉曼光谱仪样品池中，进行单次扫描采集数据，然后在数据分析中采用5 次测量的平均值，并且用自适应迭代惩罚最小二乘法算法扣除荧光等背景信号。

2 结果与分析

2.1 紫外-可见吸收光谱

图1 为纳米金胶、纳米金胶＋含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）＋硫酸镁溶液的紫外-可见光吸收光谱。

图1 紫外-可见光吸收光谱图Fig.1 UV-visible absorption spectrum

从图1a 可以看出，纳米金胶的紫外-可见吸收光谱的最大吸收峰在528 nm 处，半峰宽较窄，又由图1b可知纳米金胶、含PTS 的鸡肉提取液和硫酸镁的混合稀释液的紫外最大吸收峰约在535 nm 处，相比图1a纳米金胶的峰形，图1b 的峰形更宽且红移了7 nm。这说明纳米金胶通过加入硫酸镁溶液和含PTS 的鸡肉提取液后，使得粒子表面的等离子共振性质发生变化，其粒径大小或聚集程度也发生了变化，产生较强的共振散射信号[12-14]。

2.2 鸡肉中PTS的SERS的分析

为了确定鸡肉中PTS 的特征峰，对金胶、金胶+硫酸镁溶液、金胶+甲醇+硫酸镁溶液、金胶+PTS 标准液+硫酸镁溶液、金胶+鸡肉提取背景溶液+硫酸镁溶液和金胶+含PTS 鸡肉提取液+硫酸镁溶液6 种溶液进行拉曼光谱采集，结果如图2 所示。

图2 不同样品的SERS 光谱Fig.2 Raman spectra for different samples

曲线a～f 分别是6 种溶液的SERS 光谱信号。曲线e 与曲线 d、f 相比，曲线 d、f 均在 839、918、1 092 cm-1处出现明显的特征峰，而曲线e 未产生峰值；对曲线d、f 与 a、b、c 分析，在以上 3 处（839、918、1 092 cm-1）也均没有峰位，故在SERS 光谱检测条件下鸡肉中PTS的特征峰处于839、918、1 092 cm-1。故此考虑将839、918、1 092 cm-1处的特征峰作为PTS 的拉曼特征峰。考虑到纳米金胶、硫酸镁分别作活性基底和作活性剂时，对检测鸡肉中PTS 的SERS 光谱有一定干扰，出现一些变化，导致特征峰会发生突变，故此对特征峰需进一步确定分析。因对含PTS 鸡肉提取液进行最低检测限试验分析，当最低检测限为1 mg/L 时，839 cm-1和1 092 cm-1处能观察到明显峰值，而918 cm-1并没有出峰，故选择839 cm-1和1 092 cm-1拉曼位移约为分析鸡肉提取液中PTS 残留的特征峰。

2.3 反应时间对鸡肉中PTS的SERS强度的影响

当纳米金胶、含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）和0.1 mol/L 硫酸镁溶液充分混合时，其分子间有一个相互聚集的反应过程，在这个过程中有个决定SERS 信号增强的活性热点，在待测溶液和增强基底混合时，这个活性热点处会产生比较强的SERS 信号[15]。为了探究纳米金胶、硫酸镁溶液和待测溶液混合多久，才能产生最好的SERS 增强效果，取纳米金胶加入量500 μL、含 PTS 的鸡肉提取液加入量为 5 μL、硫酸镁溶液加入量为120 μL 置于微型离心管中混合反应，经反应时间 0、1、5、10、15、20 min 后，采集的 SERS 光谱结果如图3 所示。

图3 不同反应时间对含PTS 的鸡肉提取液的SERS 信号的影响Fig.3 Effect of different reaction time on SERS signal

当反应时间为0～20 min 时，在839 cm-1和1 092 cm-1处的拉曼特征峰下的SERS 强度于0 min 处产生最高值后快速降低至稳定状态，但考虑到反应时间为0 min时，操作难度较大，如将纳米金胶、含PTS 的鸡肉提取液和硫酸镁溶液快速加入同一2 mL 石英进样瓶中，且放入样品池进行采样，这过程容易产生操作误差，影响试验结果。由图3 又可知在1 min 时，839 cm-1和1 092 cm-1处的拉曼特征峰下的SERS 强度为次强点，说明金纳米粒子与含PTS 鸡肉提取液混合后，在不考虑0 min 产生的SERS 强度影响下，PTS 分子间与金纳米粒子相互凝聚过程中其活性热点在1 min 时，SERS 信号较强。故试验采取1 min 作为较佳的检测反应时间。

2.4 纳米金胶加入量对鸡肉中PTS的SERS光谱强度的影响

SERS 的原理是利用金属粒子周围局部电场的磁场效果来增强待测分子的散射截面，放大光谱信号[16]。故此，金纳米粒子基底也是影响SERS 信号强度的一个重要因素。分别将不同体积（0、200、300、500、700、900 μL） 的纳米金胶与 5 μL 含 PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）、120 μL 硫酸镁混合反应 1 min 后，得出不同体积的金胶下含PTS 的鸡肉提取液SERS 光谱图，结果见图4。

图4 不同加入量的纳米金胶对SERS 信号的影响Fig.4 Effect of different amount of Au nanoparticles on SERS signal

由图4 可知，在特征峰834 cm-1和1 092 cm-1下，不同金胶的量对SERS 产生的影响不同，呈现先升后降的趋势，且曲线在500 μL 金胶加入量处达到最大峰值，随后逐渐降低。经原因分析，当金纳米粒子的量慢慢变多时，其与PTS 分子接触得更为充分，使得拉曼信号有所增强；当PTS 分子与金纳米粒子体积比为1 ∶100混合时，拉曼峰信号最强，增强效果最好；若此时金纳米粒子量继续增加，过多的金纳米粒子会对PTS 分子形成较厚的包裹层，致使鸡肉中PTS 的拉曼信号降低[17]。由此可见，500 μL 金胶为检测条件最佳加入量。

2.5 待测溶液加入量对鸡肉中PTS的SERS强度的影响

影响SERS 光谱的因素有很多，例如：不同金胶的量，反应时间，待测溶液的加入量等，以上小节已经分析了反应时间、不同金胶的加入量，确定了它们的较优效果下的值（1 min 反应时间、0.8 mL 柠檬酸三钠加入量，500 μL 金胶）。根据单因素试验，分析不同待测溶液加入量对SERS 强度光谱产生的影响。试验将含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）分成 5 种（0、3、5、10、15、20 μL），分别与金胶和硫酸镁溶液混合，采集光谱信息，结果如图5 所示。

图5 不同含丙酸睾酮的鸡肉提取液加入量对SERS 信号影响Fig.5 Effect of different amounts of chicken extract containing PTS on SERS signal

随着含PTS 的鸡肉提取液加入量不断增大，特征峰在839 cm-1和1 092 cm-1处的拉曼强度不断增强。在含PTS 鸡肉提取液加入量为3 μL 时，拉曼强度达到最大值，之后随着加入量不断增加，拉曼强度开始快速下降。对这种变换趋势进行分析，当含PTS 鸡肉提取液加入量为0～3 μL 时，可能是由于PTS 分子数量随着含PTS 鸡肉提取液加入量增多而不断增多，这加大了纳米金胶粒子表面吸附PTS 分子的机率，增强了 SERS 光谱的强度[7]。当加入量大于 3 μL 后，SERS光谱强度逐渐降低，这可能是过多的含PTS 鸡肉提取液中某些物质，如蛋白质和脂肪杂质等物质增多，会影响纳米金胶粒子对PTS 分子的吸附能力[18]。综上所述，选用3 μL 为含PTS 的鸡肉提取液的最优检测条件加入量。

2.6 硫酸镁溶液加入量对鸡肉中PTS的SERS强度的影响

当含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）中PTS 分子吸附纳米金胶表面后，能使胶体产生凝固效应，加入适当的电解质会诱导和激活胶体，改变凝固状态，进而对SERS 光谱起到增强效果[19-20]。为了探究出硫酸镁溶液对检测鸡肉中PTS 残留的最优检测条件，本研究固定纳米金胶和含PTS 的鸡肉提取液（8 mg/L）的加入量分别为 500 μL 和 3 μL，然后加入不同体积量（0、30、50、70、100、120、150 μL）的硫酸镁溶液（0.1 mol/L）充分混合，对每种硫酸镁溶液体积量反应混合后的溶液进行SERS 采集，结果如图6 所示。

图6 不同硫酸镁溶液加入量对SERS 信号影响Fig.6 Effect of different amounts of magnesium sulfate on SERS signal

观察在839 cm-1和1 092 cm-1特征峰下的SERS光谱强度，硫酸镁溶液加入量为30 μL 时，此刻特征峰839 cm-1和1 092 cm-1处的拉曼强度都达到最大值，然后随着硫酸镁溶液加入量越来越多后，SERS 强度都比在30 μL 时产生的强度低。分析其原因，可能是一定量的硫酸镁溶液通过吸附PTS 分子和胶体，对产生的SERS 散射信号强度起增强作用，但过多的硫酸镁溶液可能会引发纳米金胶的团聚，使得拉曼散射强度降低[21]。故此，选择30 μL 作为硫酸镁溶液的最优加入量。

3 结论

检测条件的优化是运用表面增强拉曼光谱技术进行食品安全快速检测的重要环节。本研究通过探究检测条件的最优值，可以快速检测出鸡肉中PTS 的残留，得出准确的结果，提高试验效率，为后续的定量建模提供了基础。

对鸡肉中性激素PTS 的SERS 检测条件进行优化选择，研究不同检测条件下对拉曼光谱强度的影响，并确定最优的检测条件为500 μL 金胶加入量，3 μL含PTS 的鸡肉提取液，30 μL 硫酸镁溶液和1 min 反应时间。通过一系列条件的优化研究，完善了PTS 在鸡肉体内残留的SERS 检测方法，为以后建立系统的检测PTS 残留的SERS 技术提供了参考，也进一步的扩大和发展了SERS 技术的应用和推广。