高效液相色谱法同时测定糖足散中4 种成分的含量

徐璐娜 夏苗芬 周玉芳 袁 强

1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053；2.浙江医药高等专科学校中药学院，浙江宁波 315503；3.浙江医院药剂科，浙江杭州 310013

糖足散是浙江医院中医科应用多年的协定处方，由当归、红花、赤芍、牛膝、桂枝、细辛、乳香、桑枝、透骨草9 味中药组成，具有活血化瘀，散寒止痛等功效，临床上主要用于辅助治疗早期糖尿病足。研究表明，糖足散熏洗在一定程度上能扩张患肢血管内径，加快肢端血液的运行，配合弥可保对治疗早期糖尿病足有较好的临床疗效[1]。按患者的临床症状及特征，中医将其归属于“血痹”等痹症范畴，常用活血化瘀药进行治疗[2-4]。现药理研究也证明活血化瘀药能改善糖尿病微血管病变[5]。有显著活血化瘀疗效的当归、红花、赤芍、牛膝，是治疗糖尿病周围神经病变常用药，治疗下肢痹症方面常配伍使用，有协同增效之功[6-10]。结合2015 版《中华人民共和国药典》[11]中该4 味药的含量测定项，故把阿魏酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、β-蜕皮甾酮作为本方质量控制的指标性成分。目前虽对各自药材和复方制剂中的含量测定多有报道[12-17]，但尚无同时测定其含量的文献。为更有效控制糖足散的质量，本研究建立了同时测定糖足散中上述4 种成分含量的高效液相色谱（HPLC）法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津公司LC-20A 型高效液相色谱仪（配备CBM-20Alite 系统控制器、LC-20AT 二元泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A 柱温箱、SPD-M20A 紫外检测器、LC solution 色谱工作站）。

1.2 试药

对照品羟基红花黄色素A（批号：111637-201609）、芍药苷（批号：110736-201842）、阿魏酸（批号：110773-201614）、β-蜕皮甾酮（批号：111638-201706）均购自中国食品药品检定研究院，纯度分别为91.9%，97.4%，99.0%，98.4%。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，水（娃哈哈纯净水）。当归等9 味中药饮片均购于宁波市四明大药房，经浙江医药高等专科学校中药学院花慧教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮对照品适量，分别加70%甲醇制成贮备液（质量浓度分别为483.3940、493.3310、201.9600、199.1616 μg/mL）。精密移取贮备液羟基红花黄色素A 对照品1 mL，芍药苷对照品5 mL，阿魏酸对照品1 mL，β-蜕皮甾酮对照品2 mL，置10 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（质量浓度分别为48.3394、246.6655、20.1960、39.8323 μg/mL）。所得溶液4℃密封保存。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取当归等中药饮片适量，分别粉碎成粉末（过3 号筛），按糖足散处方中比例混匀，作为供试品。取供试品粉末约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，称重，混匀，静置30 min，超声处理30 min，放冷，称重，用70%甲醇补足减少的分量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按处方比例，制备缺红花、赤芍、当归、牛膝的阴性样品。按“2.1.2”项方法操作，即得。

2.2 色谱条件

SilverSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脱（0～5 min，10%A；5～14 min，10%～13%A；14～42 min，13%～16%A；42.01 min，90%A；42.01～58 min，90%A），流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长240 nm，进样量10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 取“2.1”项下3 种溶液各10 μL，按“2.2”项下色谱条件测定。结果各成分峰分离良好。见图1。

2.3.2 线性关系 按“2.1.1”项下方法制备混合对照品溶液，然后逐级稀释得一系列不同浓度的对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样分析，以峰面积-对照品质量浓度进行线性回归。各对照品线性相关系数（r）在0.9995～1.0000 之间，其线性关系良好。见表1。

2.3.3 精密度试验 取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6 次，记录峰面积，羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮RSD 分别为0.77%、0.11%、0.17%、0.14%。试验结果表明仪器精密度良好。

表1 4 种对照品的线性方程、线性范围、相关系数

2.3.4 稳定性试验 取混合对照品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h，进样测定，记录峰面积，其RSD 分别为羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾酮RSD 分别为0.76%、0.23%、0.23%、0.25%。表明各对照品溶液在24 h 内基本稳定。

2.3.5 重复性试验 按照“2.1.2”项制备供试品溶液，连续进样6 次，测定峰面积。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸和β-蜕皮甾酮峰面积RSD 分别为0.10%、0.08%、1.75%和0.82%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知含量（羟基红花黄色素A，1.6277%；芍药苷，3.0 643%；阿魏酸，0.0507%；β-蜕皮甾酮，0.0769%）的糖足散供试样品6 份，每份0.75 g，置于25 mL 具塞锥形瓶中，分别加入各对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样分析，计算回收率。见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.4 样品测定

取3 批不同批号的各味中药饮片，按“2.1.2”项下制备工艺制备糖足散样品3 批，分别制备成供试品溶液，进样分析，记录峰面积，采用标准曲线法，按干燥品计算样品中待测成分含量。见表3。

表3 不同批号糖足散中各成分的含量（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选

考察50%、70%和100%甲醇溶液提取溶剂，以及超声20、30、40 min 提取时间，发现70%甲醇超声提取30 min 时效率最高。

3.2 洗脱系统的选择

考察甲醇-0.1%磷酸，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸不同洗脱系统，发现以乙腈-0.1%磷酸为洗脱系统时，分离效果较好。

3.3 色谱柱的选择

考察不同长度的SilverSil C18色谱柱对4 种成分的影响，发现SilverSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离效果较好。

3.4 检测波长的选择

通过光谱扫描和2015 版《中华人民共和国药典》[11]里对4 种待测成分含量测定时给定的波长，选出230、240、250 nm 进行考察。综合考虑各检测成分峰面积大小、方中比例、检测灵敏度等，最终确定240 nm 作为检测波长。

3.5 制备工艺的改进

目前对糖足散的制备工艺，除“研磨为粉”，并无更细化的规定，譬如粉碎的细度等。曾对成品糖足散观察检测，发现同一批次粉末粗细度不均，含量差异较大。故“2.4”项的样品，没有选用浙江医院的成品糖足散，而是按特定制备工艺自制了3 批样品。

3.6 展望

桂枝、细辛能散寒止痛，是治疗痹症的常用药[18-20]，与活血化瘀药相辅相成，配伍应用后能有效改善糖尿病周围神经病变[21-24]。笔者在近期实验中发现，调整优化现有条件，有望同时分析桂皮醛、细辛脂素和上述4种成分。