EPO 在缺氧环境下对神经保护机制的研究

兰海霞 春 英 呼格吉乐

1.解放军第九六九医院儿科，内蒙古呼和浩特 010051；2.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特 010059

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE），是指在围生期发生宫内窘迫、产期窒息，引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或者暂停，导致新生儿脑组织中枢神经损伤，发病率、死亡率较高。有研究发现促红细胞生成素（EPO）除促进红细胞生成外还可以发挥神经保护作用。EPO是一种含有唾液酸的糖蛋白激素，与促红细胞生成素受体（EPOR）结合，对神经系统发挥保护作用[1]。近年来EPO 逐渐开始发展成为治疗各种神经系统疾病的有效药物[2]，如缺氧缺血性脑病、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、创伤性脑损伤和糖尿病神经病变等[3-7]。在缺血性脑损伤后，低氧的刺激使脑组织内EPO 和EPOR 表达增高[8-10]，尤其是对新生儿缺氧缺血性脑病造成的脑损伤及远期神经预后可能有改善的作用[11]。EPO 对缺氧缺血性脑病的作用是多基因共同作用的结果，目前研究结果尚不一致[12]，而且未在转录水平进行深入研究。本实验通过应用氯化钴（CoCl2）来构建U251 细胞的缺氧模型，并对缺氧模型进行评价，探讨EPO 对缺氧U251 细胞增殖能力的影响，以及EPO 对BMI1 基因在转录水平的影响，为研究EPO 在新生儿缺氧缺血性脑病中的神经保护作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

胶质瘤U251 细胞购自中国医学科学院上海细胞库，MEM 培养基（Gibco 公司，批号：8118247）；DPBS（Gibco 公司，批号：8117130）；0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，批号：1854874）；EPO（北京四环生物制药公司，批号：20180330）；RNA 反转录试剂盒（TOYOBO 公司，批号：721200）；CCK-8 试剂（上海翊圣生物科技公司，批号：C47790）。

1.2 方法

1.2.1 CoCl2构建U251 细胞缺氧模型及评价

将细胞分为对照组和CoCl2组，每组5 个，分别加入终浓度为0、400 μmol/mL 的CoCl2子溶液，每组培养24、48、72 h 后，在酶标仪上（OD450 nm 处）测定各孔吸光度（OD）值，再计算细胞活力值。细胞活力值（%）=（OD 值各加药组-OD 值空白组）/（OD 值不加药组-OD 值空白组）×100%。

1.2.2 EPO 对缺氧情况下U251 细胞增殖的影响

将细胞分为CoCl2组和CoCl2+EPO 组，加入不同浓度的EPO（EPO 浓度分别为0、75 U/mL）。每组培养24、48 h后，在酶标仪上（450 nm 处）测定各孔值，再计算细胞活力值，方法同上。

1.2.3 qPCR 法检测CoCl2组和CoCl2+EPO 组BMI1基因的转录水平

1.2.3.1 提取CoCl2组和CoCl2+EPO 组的总RNA，反转录为cDNA。按照逆转录试剂盒说明进行操作。混匀离心，在42℃15 min，98℃5 min 条件下作用20 min后，放入-20℃存放。见表1。

表1 逆转录反应体系（μL）

1.2.3.2 qPCR 实验。本实验所用到基因的引物均由上海生工生物有限公司合成，将收到后的引物瞬时离心，然后加入10 倍体积的灭菌水稀释，引物序列。并配制PCR 的体系，在冰盒上操作。见表2～3。将配好的反应体系置于PCR 仪内反应，将反应条件设为：Holding Stage：95℃，1 min 1 个循环；Cycling Stage：95℃15 s、60℃15 s、72℃45 s 共39 个循环反应；Melt Curve Stage：65℃5 s、95℃50 s 1 个循环。

表2 引物序列

表3 PCR 反应体系（μL）

1.2.3.3 计算RQ 值。RQ 值表示某一基因在对照组和实验组中的表达差异倍数，各组目的基因的Ct 值减内参基因的Ct 值为△Ct，然后用各实验组△Ct 减去对照组△Ct 算出△△Ct 值，RQ=2-△△Ct。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8 测定CoCl2对U251 细胞增殖的影响

CoCl2组U251 细胞48、72 h 时OD 值与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表4。

表4 不同浓度CoCl2处理的细胞在培养不同时间时的OD 值（）

表4 不同浓度CoCl2处理的细胞在培养不同时间时的OD 值（）

注：与对照组同时间点比较，*P ＜0.05

2.2 CCK-8 测定EPO 对缺氧情况下U251 细胞增殖能力的影响

CoCl2+EPO 组U251 细胞24 h 的OD 值为（1.257±0.035），48 h 的OD 值为（1.31±0.081）。与CoCl2组24、48 h 时OD 值比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.3 qPCR 法检测CoCl2组和CoCl2+EPO 组BMI1基因的转录水平

熔解曲线与熔解峰单一，提示扩增产物单一无非特异性产物，见图1。以CoCl2组BMI1 mRNA 相对表达量RQ 值为1，CoCl2+EPO 组RQ 值为（2.013±0.269）。CoCl2+EPO 组表达量高于CoCl2组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图2。

图1 BMI1 PCR 扩增图

图2 BMI1 PCR 熔解峰图

3 讨论

新生儿缺血缺氧性脑病（HIE）指围生期宫内窘迫、产期窒息，导致脑组织中枢神经缺氧缺血而受损害，是新生儿窒息的重要并发症，临床上发病率和死亡率均较高，是造成儿童残疾最常见的原因之一，进行早期干预是防治HIE 神经系统后遗症的有效方法。Lan 等[13]发现用EPO 治疗海马损伤模型的新生大鼠后，显著改善了神经行为学表现，避免了海马损伤诱导的神经元死亡、促进小胶质细胞活化，提示EPO可能是治疗缺氧缺血诱导的新生儿脑损伤的有效方法。因此本实验使用CoCl2建立体外细胞缺氧模型来模拟新生儿缺氧时脑内低氧环境，研究EPO 对缺氧环境下神经胶质U251 细胞的保护作用。

CoCl2作为化学低氧诱导剂常常被用来制造缺氧模型，具有稳定转录因子HIF-1α 和模拟缺氧的作用。CoCl2能够在铁的结合中心用钴代替铁的脯氨酰羟化酶来降低羟化活性，促进HIF-1α 的生成进而模拟体内缺氧微环境[14-15]。Zhang 等[16]应用CoCl2构建体外乳腺癌细胞的缺氧模型，发现CoCl2通过促进HIF-1α 的表达，来抑制细胞的增殖。依据预实验的结果和参考文献，将作用细胞的CoCl2浓度分为0 μmol/mL和400 μmol/mL，分别培养细胞24、48 h 和72 h 后，运用CCK-8 实验检测U251 细胞的增殖情况。本研究结果显示，当CoCl2浓度400 μmol/mL 时能够抑制U251 细胞的增殖能力，提示缺氧模型构建成功。

EPO 是由多肽和糖基构成，是一种单链的酸性糖蛋白。EPO 发挥生理作用时需要与EPOR 结合，通过JAK2 及其他信号通路促进红细胞与血管生成和作用于红系祖细胞增殖、分化和成熟等。EPO 和EPOR 在人类、啮齿类动物的大脑中广泛分布。Traudt 等[17]发现，EPO 对缺氧缺血引起的脑损伤能有重要的神经保护作用。本实验将一定浓度EPO 加入到U251 细胞CoCl2缺氧模型中培养细胞，并采用CCK-8 法检测。结果显示，75 U/mL 的EPO 能够促进缺氧条件下U251 细胞的增殖，发挥神经保护作用。

BMI1 基因由9 个外显子和9 个内含子组成，是多梳基因家族（PcG）的重要成员之一。在体内通过与c-myc 蛋白共同作用，抑制INK4a 位点，从而调控细胞增殖[18]。BMI1 基因在胃肠道间质瘤组织中的表达增加，表达量与胃肠道间质瘤的危险度分级相关，增殖基因Cyclin Dl 的表达，抑制凋亡基因caspase-7 的表达[19]。BMI1 基因与位于中枢和周围神经系统中的神经干细胞的自我更新密切相关。BMI1 基因缺陷的神经干细胞自我更新能力下降，神经干细胞细胞周期蛋白依赖激酶抑制基因p16Ink4a 上调，神经干细胞增殖速度下降，同时细胞数量也随时间逐渐下降。干扰p16Ink4a 基因的表达，使神经干细胞重新获得自我更新能力。这些发现提示，BMI1 基因能够抑制p16Ink4a基因，提高神经干细胞的自我更新能力[20]。本研究结果显示，在缺氧条件下EPO 能够提高U251 细胞的增殖能力并促进BMI1 的表达，提示EPO 可能通过上调BMI1 的表达来实现对神经细胞的保护作用。

本研究使用CoCl2成功构建U251 细胞缺氧模型，外源性给予EPO 处理缺氧环境下的U251 细胞，发现EPO 可以促进缺氧环境下神经胶质U251 细胞的增殖，并且可以上调BMI1 的转录水平。提示EPO 可能通过上调BMI1 的表达来实现对神经细胞的保护作用。此外，进一步阐明EPO 对缺氧神经细胞的保护作用，为EPO 在HIE 治疗中的作用提供有意义的分子基础机制，为治疗HIE 提供新思路。