响应面法优化复方北冬虫夏草颗粒多糖提取工艺的研究

李英娜，潘美彤，苑广信，安丽萍，徐广宇

（北华大学药学院，吉林吉林132013）

失眠可引起患者焦虑、抑郁或恐惧心理，并导致精神活动效率下降，日益成为威胁人类健康的杀手[1]。据世界卫生组织调查，我国失眠人群大约占55%。流行病学调查显示，失眠的患病率为40%左右[2]。失眠会带来一系列的危害，降低生活质量、加快衰老，严重影响人们的正常生活和身体健康[3]。

中药在我国有着悠久的历史，其来源于天然产物，毒副作用较小，可以长期服用，因此特别适合于睡眠障碍等亚健康状态的调理和治疗[4]。复方北冬虫夏草颗粒是本团队根据中医理论将北冬虫夏草、灵芝、甘草、大枣、小麦、桔梗进行科学配伍，开发的一种有助于改善睡眠的复方保健食品，其主要功效成分为多糖。多糖具有多种生物活性功能，被广泛应用到功能食品和临床上[5]。为了更有效地提取多糖，充分利用资源，提高复方北冬虫夏草颗粒质量，本研究通过设计星点Box-Behnken 响应面试验，对多糖提取工艺进行优化，以期为复方北冬虫夏草颗粒的综合开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 材料和试剂

甘草、桔梗、小麦：安国市深豪药业有限公司；北冬虫夏草：沈阳聚鑫北虫草菌业有限公司；灵芝：河北百合中药饮片有限公司；大枣：樟树市庆仁中药饮片有限公司；无水乙醇：辽宁泉瑞试剂有限公司；重蒸酚：沈阳鼎国有限公司；浓硫酸：天津市凯信化学工业有限公司；葡萄糖标准品：上海宏瑞化工有限公司；试验所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；HH S1-Ni 电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；GZX-9140ME 数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；4 ℃冷藏冰箱：青岛海尔集团公司；LC-4012 台式离心机：美国eppeendorf 公司；XW-80A 旋涡混合器：上海青浦沪西仪器厂；UV-2550 紫外可见分光光度计：岛津国际贸易有限公司。

2 方法

2.1 物料的前处理

北冬虫夏草、甘草、桔梗、小麦：使用前过20 目筛，除去杂质、异物，备用；大枣，灵芝：使用前过20 目筛，除去杂质、异物，破碎成小块，备用[6]。

2.2 多糖的提取方法

取配方比例的北冬虫夏草2 g、甘草6 g、桔梗6 g、灵芝 6 g、小麦 18 g、大枣 12 g，共 50 g，准备 17 份，按照响应面法设计方案进行提取、过滤，合并每次滤液、浓缩、干燥、粉碎得干膏粉，测定出膏率及干膏粉中粗多糖含量。以100 g 药材中粗多糖的提取得量为指标，进行数据分析。

1）出膏率的计算：出膏率/%=干膏粉得量/投药材总量×100

2）粗多糖的测定：参考《保健食品功效成分检测方法》（2011 年版）中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法”测定[7]。

葡萄糖标准曲线的绘制，取干燥后的无水葡萄糖对照品20.00 mg，置于200 mL 容量瓶中，加适量去离子水溶解，稀释至刻线，振荡摇匀，该液体即为葡萄糖标准溶液0.1 mg/mL。在25.0 mL 比色管中，分别量取葡萄糖标准品溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，添加去离子水至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，涡旋混合器混匀10 s，加入浓硫酸10.0 mL，涡旋混合器混匀35 s，置于沸水浴2 min，自然冷却至21 ℃，用紫外-可见分光光度仪检测样品在485 nm 处的吸光度，每个样品平行测定3 次[6]。以葡萄糖浓度作横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。曲线方程为：y=0.013 7x+0.009 5，R2=0.999 6。

具体样品处理过程：取干浸膏50 mg，加适量水，振摇使溶解，定容至100 mL，取2.0 mL 于15 mL 离心管中，加8.0 mL 无水乙醇，混匀，4 ℃冰箱静置过夜。4 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，反复4 次。洗涤后的残渣用水溶解并定容于10 mL 容量瓶中，待备用。取适量样品溶液，补加蒸馏水至2.0 mL，混匀后加入1.0 mL 5%苯酚溶液，涡旋混合器混匀10 s，加入浓硫酸10.0 mL[8]，涡旋混合器混匀35 s。置于沸水浴2 min，自然冷却至21 ℃，紫外分光光度计在485 nm 波长处检测吸光度，计算样品的粗多糖含量[9]。

3）100 g 药材中粗多糖得率/%=多糖含量/样品质量×100

2.3 单因素试验设计

在料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），提取时间分别为 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，浸泡时间分别为 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次数 1、2、3、4 次的条件下，按照2.2 的得率计算方法，进行料液比、提取时间、浸泡时间、提取次数4 个因素对复方北冬虫夏草颗粒多糖得率的影响试验。

2.4 Box-Behnken 设计星点响应面法试验设计

本研究根据星点设计原理，通过对保健品多糖提取率的主要影响因素：料液比（A）、提取时间（B）、浸泡时间（C）进行了优化试验。综合多因素考虑，试验采用三因素三水平对提取工艺进行优化，因素水平见表1，并对所得数据进行二次回归拟合，求得回归方程。

表1 试验因素水平编码Table 1 The level coding of experimental factors

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比对多糖得率的影响

在提取时间为2 h、浸泡时间为2 h、提取次数为3 次的条件下，料液比分别为 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）下进行料液比对多糖得率的影响试验，见图1。

图1 料液比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of ratio of solid to liquid on yield of polysaccharide

由图1 可知，多糖得率在料液比从 1 ∶5（g/mL）至1 ∶15（g/mL）之间呈依次递增的趋势，并且料液比在1 ∶15（g/mL）时达到最大值，再增加溶液体积，提取率反而缓慢降低，同时增加液体体积还增加浓缩的工作量，从而增加了成本，因此，选择适宜的料液比为1 ∶15（g/mL）。

3.1.2 提取时间对多糖得率的影响

在料液比为 1 ∶15（g/mL）、浸泡时间为 2 h、提取次数为3 次的条件下，选取提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，进行提取时间对多糖得率的影响试验，见图2。

图2 提取时间对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由图2 可知，多糖得率在提取时间从0.5 h 至2 h之间呈递增的趋势，并且提取时间在2 h 时达到较大值，往后趋于平缓。表明提取时间在一定范围内可以增加多糖得率，但时间过长会导致多糖结构的破坏。因此，结合多糖得率以及在节省时间的考虑下，选择较优的提取时间为2 h。

3.1.3 浸泡时间对多糖得率的影响

在料液比为 1 ∶15（g/mL）、提取时间为 2 h、提取次数为3 次的条件下，选取浸泡时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 进行浸泡时间对多糖得率的影响试验，见图3。

图3 浸泡时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of soaking time on polysaccharide yield

由图3 可知，多糖得率在浸泡时间从0.5 h 至2 h之间呈依次递增的趋势，并且浸泡时间为2 h 时达较大值。多糖得率从2 h 至3 h 放缓，可能是由于2 h 时复方北冬虫夏草多糖已经大部分浸泡出来。因此，结合多糖得率和实际操作选择较优的浸泡时间为2 h。

3.1.4 提取次数对多糖得率的影响

在料液比为 1 ∶15（g/mL）、提取时间为 2 h、浸泡时间为2 h 的条件下，选取提取次数分别为1、2、3、4 次下进行提取次数对多糖得率的影响试验，见图4。

图4 提取次数对多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the yield of polysaccharide

由图4 可知，多糖得率随提取次数的增加而上升，提取3 次时多糖基本已被提取出来，此后继续增加提取次数，多糖得率呈缓慢上升趋势。因此，从工作量和成本考虑，选取3 次为单因素试验最佳提取次数。

3.2 Box-Behnken设计星点响应面法优化提取工艺试验结果

本研究根据星点试验设计，保健品多糖的提取工艺进行优化。试验结果见表2。

表2 响应面法设计方案及试验结果Table 2 Design and test results of response surface methodology

通过对模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应面二次回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic regression

由表3 可以看出，模型的P＜0.01，表明模型高度显著，调整确定系数R2=90.18，说明试验数据真实可靠。在方差分析中，该模型的F 值为7.14，P＜0.01，表明回归方程拟合度好且具有统计学意义。模型失拟项的P＞0.05，说明未知因素对试验结果的干扰很小，失拟项差异不显著，试验无失拟因素存在，能充分反映实际情况，回归模型是适合的[10]；试验模型的决定系数R2=0.901 8，说明多糖得率的结果与模型预测结果有着良好的一致性，试验模型的校正系数R2Adj=0.775 6，试验结果有77.56%受试验因素的影响。因此，结果可靠，此模型可以对多糖得率结果进行分析和预测。

响应面分析法是一种用于在多因素系统中寻找最佳测试条件的统计方法[11]。利用Design-Expert 8.0软件[12]对表3 试验数据进行二次多项式回归拟合，得到多糖含量对料液比（A）、提取时间（B）、浸泡时间（C）的回归模型方程为：R1=31.07+1.73×A-0.14×B+1.32×C+0.35×AB-0.45×AC-0.58×BC-2.21×A2-1.62×B2-1.64×C2（R2=0.901 8）。

回归方程各项方差分析中F 检验可以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对多糖得率影响的主次顺序为料液比＞浸泡时间＞提取时间，即料液比对多糖得率的影响最大，其次是浸泡时间，最后是提取时间。由回归方程和方差分析还可知[13]，模型中一次项料液比对多糖得率的影响达到极显著水平（P＜0.01），因素C 对多糖具有显著影响（P＜0.05），提取时间及其余各项的影响均不显著（P＞0.05）；模型中二次项A2对多糖得率的影响达到极显著水平（P＜0.01）；且料液比、浸泡时间、提取时间对总黄酮保留率的影响均不具有显著的交互性（P＞0.05）。

3.3 通过Box-Behnken试验得到的多元二次回归模型所作的响应面图

本研究又通过Box-Behnken 试验得到的多元二次回归模型所作的响应面图见图5～图7，响应面图形是响应值对各试验因素A、B、C 所构成的三维空间的曲面图。在其他试验因素固定不变的情况下，考察交互项对得率的影响，响应面分析图可用于评价试验因素对多糖得率影响的两两交互作用[14]。

响应面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，该因素对多糖得率的影响越大；反之则表明因素对多糖得率的影响越小[14]。通过观察，响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映料液比（A）、提取时间（B）、浸泡时间（C）之间交互作用对多糖提取量的影响，当等高线呈圆形时表示两因素交互作用不显著，而呈椭圆形或马鞍形时则表示两因素交互作用显著[15]。

图5 料液比与提取时间的等高线与响应面（C=0）Fig.5 Contour and response surface of liquid-to-liquid ratioand extraction time（C=0）

图6 料液比与浸泡时间的等高线与响应面（B=0）Fig.6 Contour and response surface of liquid-to-liquid ratioand soaking time（B=0）

图7 提取时间与浸泡时间的等高线与响应面（A=0）Fig.7 Contour and response planes for extraction time and soak time（A=0）

由图5 可知，当A 料液比一定时，多糖提取率随着提取时间的增加呈现出先增大后减小的趋势；同样，当B 提取时间一定时，多糖提取率随着A 料液比的增加呈现出先增大后减小的趋势。

由图6 可知，当C 浸泡时间一定时，多糖提取率随A 料液比的增加呈现出增大趋势；当A 料液比一定时，多糖提取率随着C 浸泡时间的增加呈现出减小趋势。

由图7 可知，当B 提取时间一定时，多糖提取率率随C 浸泡时间的增加呈现出先增后减的趋势；当C浸泡时间一定时，多糖提取率随B 提取时间的增加呈现出先增加后趋于减小的趋势。通过分析三者的交互作用，发现因素B 与C 的相互作用对多糖提取率影响最大。

3.4 组合物最佳提取工艺验证试验

通过优化后的提取条件（提取时间2 h、浸泡时间2.4 h、料液比 1 ∶16.75（g/mL）对保健品多糖提取进行验证试验，分别进行了5 次重复试验，结果分别为32.17 %、32.15 %、32.16 %、32.17 %、32.18 %，平均32.17%，与理论值32.21%非常接近，证明应用响应面法优化保健品多糖提取工艺方法可行可靠。

4 结论

响应面法（response surface methodology，RSM）是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[16-18]。与正交试验设计法不同，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，可研究几种因素间交互作用等优点[19]。本研究以水提法提取保健品组合物中的多糖，采用响应面分析法优化了工艺。最佳提取条件为料液比 1 ∶16.75（g/mL）、提取时间 1.93 h、浸泡时间 2.37 h、提取次数3 次。利用响应面分析法所得结果表明料液比对中药多糖得率影响最大，再者是浸泡时间和提取时间，通过对提取工艺的优化，特别是对提取时间的调控，可以获得较高的多糖得率[20-22]。保健品多糖提取工艺的优化可以有效地提高多糖得率，提高保健品的综合利用率，为保健品的进一步应用研究提供了理论依据。