响应面法优化超声辅助提取黑芝麻黑色素的工艺

陈静，丁洁，沙芮，洪妍，牛犇

（甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730010）

近年来，黑色食品备受追捧，大量研究表明，黑色食品是具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤、降血脂、养血补肾、乌发美容等功效[1-2]，而黑色食品之所以会发挥这些作用，是由于它们本身所含有的黑色素，因此研究天然黑色素的提取及优化提取方法具有深刻的应用价值。

黑芝麻是脂麻科（胡麻科）脂麻属的黑色种子，是世界上的主要油料作物之一。在亚洲、南美洲和中美洲的许多国家均有大量种植。我国是芝麻生产大国，因芝麻产量居世界之首，因而有“芝麻王国”之称。黑芝麻黑色素就是一种天然黑色素，是一类安全、无毒的天然食用色素，具有重要的生物活性，同时也是黑芝麻中较强的抗氧化成分之一，具有良好的水溶性、光稳定性、热稳定性，耐氧化还原等优良的物理性质[3-4]。根据全血化学发光强弱作为抗活性氧大小的指标，黑芝麻色素对全血化学发光有较强的抑制作用，黑芝麻色素对细胞或非细胞体系所产生的活性氧都有较强的清除作用，提示它是黑芝麻成分中较强的自由基清除剂之一[5]。

据文献报道，目前关于黑色素的提取方法主要有4 种：（1）碱溶酸沉法，根据黑色素溶于碱性溶液而不溶于酸性溶液的性质，在碱性环境进行提取，然后酸化至酸性环境，使色素形成沉淀析出，即得到黑芝麻黑色素[6-8]；（2）醇提法，乙醇或酸性乙醇均作为黑色素的萃取溶剂[9-10]；（3）酶提法，Yu 等利用酶法从栗子壳中分离黑色素，将生物材料用蛋白酶进行连续酶促处理，如胶原酶、蛋白酶等，从而获得栗子壳黑色素[11-12]；（4）酸提法，张沙艳和胡春霞从毛发中提取黑色素，将洗净晾干的人发置于30 %的浓盐酸中，在110 ℃～112 ℃条件下，加热回流4 h，冷却，收集滤渣，即得毛发黑色素粗提物[13]。考虑到此类天然黑色素均不能够溶于常见的有机溶剂，同时不能溶于酸性溶液，而微溶于水，且易溶于碱性溶液。同时，之前学者所用碱溶酸沉法提取黑芝麻色素常见的萃取溶剂为NaOH 和盐酸，均为强酸和强碱，本试验尝试使用碳酸氢钠作为萃取溶剂对黑芝麻色素进行提取，碳酸氢钠作为小苏打可食用，提取所得的黑色素较为安全，可用作食品添加剂，因而具有更广泛的应用价值。

1 材料与仪器

1.1 材料

黑芝麻：产地云南；碳酸氢钠：天津市化学试剂三厂。

1.2 仪器

METTLER AE100 型电子分析天平：上海梅特勒-托利多仪器；KQ-500DB 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UPH-1-40L 优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；UV2300II 型双光束紫外可见光光度计：上海天美科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑芝麻黑色素的提取工艺

准确称取10 g 黑芝麻，水洗干净后，滤干备用，配制8 g/L 碳酸氢钠溶液（根据预试验，尝试了3 g/L～10 g/L 碳酸氢钠溶液作为萃取溶剂，8 g/L 碳酸氢钠溶液提取黑色素得率最高）作为萃取溶剂，pH 值为8.8。使用溶剂将芝麻浸没后，在一定功率超声波提取仪中进行搅拌提取，超声结束后对溶液进行抽滤，将滤液放置于70 ℃烘箱进行烘干，即得黑芝麻黑色素，得率计算公式如下：

式中：D 为得率，%；m 为黑色素质量，g；W 为黑芝麻质量，g。

1.3.2 黑芝麻黑色素最大吸收波长的确定和色价的计算

取一定量提取的黑芝麻色素，用pH 值为8.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配置成一定浓度的溶液，使用紫外分光光度计对其进行全波长扫描，得到其最大吸收处波长λmax。精确称取色素0.05 g，溶于pH值为8.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，并定容至100 mL，摇匀。从中吸取1 mL 色素溶液，用同样的缓冲溶液定容至10 mL。在λmax处测定稀释后的色素溶液的吸光值，计算色价。色价的计算公式如下：

式中：E 为色阶；A 为吸光值；n 为待测样品稀释倍数；W 为样品质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

黑芝麻10 g，水洗沥干，以碳酸氢钠溶液作为提取溶液，在提取温度 30、40、50、60、70 ℃；超声波提取功率 60 %、70 %、80 %、90 %、100 %（即 300、350、400、450、500 W）；提取时间 15、30、45、60、75 min；料液比1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）；进行搅拌提取，过滤，滤液放置70 ℃烘箱内进行烘干，得黑芝麻黑色素，测定其吸光度，并计算黑色素得率和色价。

1.3.4 提取条件的响应面优化设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 中心组合设计原理，利用Design-Expert 8.0.6 软件对料液比、提取温度、提取时间和超声功率四因素设计四因素三水平的响应面试验，以黑色素得率和色价为响应面值，因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken 中心组合设计Table 1 Central composite design

1.4 数据处理

单因素试验数据处理及趋势线由Excel 2010 计算得出；采用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面试验设计，并对试验结果采用二次回归模型进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 黑芝麻黑色素最大吸收波长的确定

黑芝麻黑色素的紫外可吸收光谱见图1。

图1 黑芝麻色素的紫外可见吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet visible absorption spectra of black sesame pigment

由图1 可以看出黑芝麻色素的紫外光谱图在波长为213 nm 下有最大吸收峰。故选择以213 nm 为黑芝麻黑色素的最大吸收波长。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 料液比对黑芝麻色素提取的影响

固定超声波提取功率为100%，提取温度为40 ℃，提取时间为30 min，对色素提取情况进行分析。料液比对黑芝麻黑色素得率及色价的影响见图2。

图2 料液比对色素提取效果的影响Fig.2 Effect of solid liquid ratio on pigment extraction

从图2 可以看出，当料液比由 1 ∶3（g/mL）升至1 ∶5（g/mL）时，得率有显著提高，当料液比为 1 ∶3（g/mL）时，芝麻溶于水中后没有多余提取液，使得黑色素溶解不完全，提高料液比后黑色素得率明显提升，而料液比由 1 ∶5（g/mL）升至 1 ∶7（g/mL）时，得率无明显变化，说明黑色素的提取已达到平台期；而随着料液比的增加，色价呈现先降低后升高的趋势，考虑到提取溶剂的用量及后续提取物的浓缩及烘干试验，选取料液比为1 ∶5，响应面中料液比的取值范围为1 ∶4（g/mL）～1 ∶6（g/mL）。

2.2.2 提取温度对黑芝麻色素提取的影响

固定超声波提取功率为100%，料液比为1∶3（g/mL），提取时间为30 min，对色素提取情况进行分析。提取温度对黑芝麻黑色素得率及色价的影响见图3。

图3 提取温度对色素提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on pigment extraction

从图3 可以看出，随着提取温度的升高，色素得率呈现逐渐上升的趋势，当温度由50 ℃继续向上升时，得率基本维持不变。水分子是不断运动的，温度越高水分子运动速率越快，溶质在溶液中的扩散速度就越快，所以黑色素溶解速率越快，但此时杂质也更易溶出而且黑色素的分解也在加速，使黑色素纯度降低，因而温度超过60 ℃后色价开始降低，故选择50 ℃作为提取温度，响应面设计试验中温度的选择范围为40 ℃～60 ℃。

2.2.3 提取时间对黑芝麻色素提取的影响

固定超声波提取功率为100%，料液比为1∶3（g/mL），提取温度为40 ℃，对色素提取情况进行分析。提取时间对黑芝麻黑色素得率及色价的影响见图4。

图4 提取时间对色素提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on pigment extraction

从图4 可以看出随着提取时间的延长，色素得率呈现先增后降的趋势，在提取时间为45 min 时，得率达到最高点。说明黑色素的溶出是一个渐进的过程，但随着提取时间的增加，溶出的杂质也会增多，影响纯度。而色价随着提取时间的增加呈现先降后升的趋势。考虑到色价和得率两个因素，以及提取的时间成本，选择提取时间为45 min，响应面试验中提取时间的范围为30 min～60 min。

2.2.4 超声功率对黑芝麻色素提取的影响

固定料液比为 1 ∶3（g/mL），提取温度为 40 ℃，提取时间30 min，对色素提取情况进行分析。超声功率对黑芝麻黑色素得率及色价的影响见图5。

图5 超声功率对色素提取效果的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on pigment extraction

从图5 可以看出，随着超声功率的升高，色素得率呈现先增后降的趋势，在超声功率为80%的条件下，色素得率达到最高点，而色价基本呈现增长趋势，但同时考虑色价和得率两个因素，选择超声功率80%为提取功率，响应面试验中提取功率的范围为70%～90%。2.3 响应面试验结果分析2.3.1 回归模型方差分析

在单因素试验结果的基础上，以提取时间、料液比、超声功率和温度4 个因素为自变量，以黑色素得率和色价为响应值，运用Design-Expert 8.0.6 进行四因素三水平的试验设计，共包括29 个试验点，其中24 个为析因点，5 个为零点以估计误差。试验设计方案和结果见表2。

表2 Box-Behnken 设计方案及响应值结果Table 2 Design scheme and response value results

续表2 Box-Behnken 设计方案及响应值结果Continue table 2 Design scheme and response value results

利用Design-Expert8.0.6 软件对结果进行分析，拟合得到黑色素得率及色阶的多元回归模型：

对回归模型进行方差分析，结果见表3 和表4，料液比、超声功率、提取温度和时间对色价及得率有显著正效应，模型P 值均＜0.01，说明回归模型极显著。失拟项P 值均＞0.05，P 为不显著，说明回归模型显著。决定系数R2分别为0.977 0 和0.983 3，均大于0.9，说明回归模型拟合良好。

由表3 中各因素P 值的大小可知，提取时间和料液比对得率的影响极显著，且提取时间与料液比、提取时间和超声功率、提取时间和温度、料液比和温度的交互作用对得率的影响达到了极显著的水平，各因素对得率的影响排序为A（时间）＞B（料液比）＞D（温度）＞C（超声功率）；由表4 中各因素P 值的大小可知，提取时间和温度对色价的影响极显著，且超声功率和温度的交互作用对色价的影响达到了极显著的水平，各因素对色价的影响排序为A（时间）＞D（温度）＞B（料液比）＞C（超声功率）。

表3 二次回归模型对得率的方差分析结果Table 3 The variance analysis results of the quadratic regression model on receiving rate

表4 二次回归模型对色价的方差分析结果Table 4 The variance analysis result of the quadratic regression model on the color price

2.3.2 因素交互作用分析

为了进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点[14-15]，利用Design-expert 软件分析二次回归模型，绘制响应面分析立体图和等高线图。图6～图7 为响应面分析立体图和等高线图。

等高线为椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则与之相反，响应曲线能直观地反映各因素对响应值的影响。图6 为一种因素水平为0 时，另外两因素对黑芝麻黑色素得率的交互作用。由图6 可看出，图6 中a、b、c、e 的等高线均为椭圆形，其中图 6a 和图 6b 的3D 曲面坡度最大，所以提取时间与料液比、提取时间与超声功率、提取时间与温度、超声功率与温度的交互作用对黑色素得率的影响极显著，而料液比与超声功率及超声功率与温度的交互作用对黑色素得率的影响不显著。

图6 各因素相互作用对黑色素得率的影响Fig.6 The effects of various factors on the melanin receiving rate

图7 各因素相互作用对色价的影响Fig.7 The effects of various factors on the color price

图7 为当一种因素水平为0 时，另外两因素对色价的交互作用。由图7 可看出，图7 中仅图7f 的等高线为椭圆形，即超声功率与温度的交互作用对色价的影响极显著，其余各交互因素均对色价影响不显著。

3.4 验证试验结果

对试验模型进行分析得出超声波提取黑芝麻黑色素的最佳工艺条件为提取时间45.15 min、料液比1 ∶5.05（g/mL）、超声功率 79.97 %、超声温度 43.5 ℃，考虑到实际操作情况，将最佳试验条件调整为提取时间 45 min、料液比 1 ∶5（g/mL）、超声功率 80%、超声温度44 ℃，实际测得芝麻黑色素得率为4.438%，与理论值4.412 %相比误差为0.59 %；色价为197.318，与理论值196.445 相比误差为0.44%。因此本试验得到的最优条件准确可靠，具有一定的参考价值。

3 结果与讨论

本试验采用响应面法来优化黑芝麻黑色素提取工艺中提取温度、提取时间、超声功率及料液比4 个因素对黑色素得率及色价的影响。由此建立的多项回归方程模型能较好的反应实际提取效果，得到最佳提取工艺参数为：提取时间 45 min，料液比 1 ∶5（g/mL），提取温度44 ℃，超声功率80%，最终提取黑芝麻黑色素的得率为4.438%，色价为197.318。

用碳酸氢钠作为提取溶剂来提取黑芝麻中的黑色素，减少了强碱强酸对色素的影响，所得色素可放心地用于食品、保健品等可食用产物的生产工艺；同时，采用超声波辅助提取法分离成分，相比加热回流提取法，试验周期短，操作简单，是提取黑色素的可选途径。运用此方法对芝麻黑色素进行提取可以有效提高生产效率、节约成本，为黑芝麻黑色素进一步研究提供技术参考和理论依据。