正强化训练对笼养黑叶猴粪便代谢组的影响

何 鑫 王福云 张秀秀 朱 岩

(杭州动物园，杭州，310008)

圈养野生动物的生存环境与野外有较大的差异，除了受限制的空间、游客的干扰外，还有一些如动物的运输、医疗、健康检查等必要常规的管理手段，而这些管理手段对野生动物来说都是一种胁迫(stress)[1]，严重的会引起动物强烈的应激，甚至导致死亡。近年来，正强化行为训练(positive reinforcement training，PRT)作为一种社群关系丰容手段，开始运用于圈养动物的饲养管理[2-3]。研究表明，通过适当的行为训练，对减少黑猩猩(Pantroglodytes)的刻板行为和压力水平有显著的作用[3-4]；另一方面，也能减少保育人员受动物袭击引起的伤害事故[5]。国内相关动物训练研究也相继在猩猩(Pongopygmaeus)[6]、赤大袋鼠等(Macropusrufus)[7]、非洲象(Loxodontaafricana)[8]等动物上开展。

黑叶猴(Trachypithecusfrancoisi)别名乌猿，属灵长目(Primates)猴科(Cercopithecidae)疣猴亚科(Colobinae)，主要分布于中国的广西、贵州及重庆。列为中国Ⅰ级重点保护动物。自20世纪90年代至今，由于栖息地缩减及人为影响，野外数量急剧下降，目前野外种群数量约为1 700余只[9]。截至2017年圈养种群为342只个体[10]。以前已针对野外黑叶猴开展分布、食性、活动节律等方面的研究[11-14]，针对笼养黑叶猴，集中在行为、生殖生理、营养等方面[15-18]，并未有针对黑叶猴的训练记录，也未曾针对正强化训练对动物的生理影响展开研究。

代谢组(metabolome)技术是近二十年发展起来的研究技术，主要关注机体的代谢终产物[19]。通过代谢产物的变化，可进而推导潜在代谢过程的改变，因此代谢组已被用于评价环境刺激对机体生理代谢过程的影响。在以大鼠为模型，采用代谢组手段研究抑郁症与代谢产物的关联性中发现，抑郁症的产生可能与机体糖代谢的异常有关。其中，甘氨酸、谷氨酸、果糖、柠檬酸和葡萄糖和棕榈酸可以作为生物标记物，为诊断和治疗抑郁症提供定量依据[20]，而针对野生动物代谢组研究却几乎为零。

杭州动物园目前饲养2只黑叶猴，其中成年雄性“大杭”个体年龄较大，需要定期做体检。因此对该动物个体进行正强化训练，训练目标是肌肉注射。本实验在2018年6—8月间进行，对笼养的黑叶猴进行30 d的正强化的训练，希望通过代谢组分析了解行为训练对动物生理的影响，为进一步找到合适的动物福利标记物提供理论依据。

1 研究方法

1.1 研究对象

以杭州动物园饲养的1只黑叶猴为研究对象，呼名是“大杭”。个体与另一雌性个体饲养在一间笼舍。笼舍大小为7 m×8 m×5 m，笼舍面向游客的一面为玻璃，其余两面为钢筋铁丝网结构。水泥地面，有假山石块、钢管、木栖架及消防绳索的丰容设施。笼内后方有1.5 m×1 m保温用笼箱，内有油汀。供动物夜间休息，躲避风雨，防寒保暖用。喂食时间为每天的10：00及15：00。食谱包括树叶、鸡蛋、馒头、玉米、水果、红枣、花生等。花生为动物较喜爱吃的食物。在训练时，将花生从饲料中挑出，作为强化物单独喂食。实验期间，大杭的饲料种类和数量保持不变。每天进食时，将大杭隔离，饲料进食完毕后，再将大杭放回社群。在实验期间，大杭未发生疾病等情况。

1.2 正强化训练

对大杭进行正强化训练，训练的目标为肌注。训练的方法为正强化刺激，强化物为花生。桥接信号为响片声。具体步骤见图1，整个训练过程均由一名保育员完成。每天的训练时间为喂食前30 min，训练完毕后进行日常饲料的饲喂。训练内容详见表1。

图1 正强化训练步骤Fig.1 The steps of positive reinforcement training

表1 黑叶猴训练项目

Tab.1 Training items for françois’ langur

1.3 粪便的采集和测定

1.3.1 样品采集及提取

6月1日至8月1日，于隔天8：30采集2只个体的新鲜粪便，用封口袋装好后，带回实验室，称取1 g加叠氮化钠后，于-70度保存。每个个体采样20次。在室温下解冻样品后，向1.5 mL离心管里加入30 mg样本及20 μL的内标液体(L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置)。再加入600 μL甲醇-水溶液(4∶1)，于-80 ℃下静置2 min后再研磨2 min，离心(13 000 rpm，4 ℃，15 min)，吸取400 μL的上清液，装入玻璃衍生瓶中，离心浓缩干燥器干燥样品，向干燥物中加入80 μL的甲氧明盐酸盐吡啶溶液(15 mg/mL)，37 ℃肟化反应 90 min。取出样品后再加入80 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生试剂和20 μL的正己烷，70 ℃反应60 min。取出样本后室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。

1.3.2 GC-MS分析条件1.3.2.1 色谱条件

样本用不分流模式注入GC-MS系统进行分析，气相色谱质谱联用仪(7890A-5975C，Agilent，USA)，进样量1 μL，经气象色谱柱(HP-5MS，Agilent J&W Scientific，USA)分离后进入质谱检测，高纯氦气(6.0 mL/min)为载气，进样口温度280 ℃。升温程序为：初始温度60 ℃升至125 ℃(8 ℃/min)，至190 ℃(10 ℃/min)，再升至210 ℃(4 ℃/min)，最后至310 ℃(20 ℃/min)，维持8.5 min。

1.3.2.2 质谱条件

采用随机顺序进行连续样本分析，电子轰击离子源(EI)，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，经全扫描模式扫描(SCAN，m/z 50—600)。

1.4 数据分析

个体采样20次。将大杭训练前的采样组为AT1组，训练之后为AT2组，每组10次采样，进行两组比较和数据分析。通过统计学方法，分析每个样本的代谢组信息。20个样品的数据经ChromaTOF软件进行预处理及归一化，将整合后的数据矩阵导入SIMCA-P+14.0，先采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA来区分各两组间代谢轮廓的总体差异，用(O)PLS-DA模型第一主成分的VIP值(VIP>1(Simca-P14.1))，结合P值(Pvalue<0.05(T-test))来寻找差异代谢物。

2 结果

2.1 粪便代谢轮廓分析

从典型总离子流图中看出，大杭在训练前后的代谢物有明显差异(图3)。

图2 黑叶猴粪便基峰强度色谱图Fig.2 Typical fecal base peak intensity chromatogram in Dahang

2.2 偏最小二乘法分析(PLS-DA)

由AT1-AT2组的偏最小二乘法分析(PLS-DA)进行模型分析，获得3个主成分，R2y=0.951，Q2=0.502，得分如图3所示。模型的解释率R2y和预测率Q2较大，说明PLS-DA模型适合解释两组样本间的差异。如图3所示，两组样本处于得分图的左右两个区域，表示经过30 d的行为训练后，大杭自身的粪便代谢物发生了显著变化。

图3 AT1-AT2的 PLS-DA的得分图Fig.3 PLS-DA scores of fecal from group group AT1-AT2

2.3 (正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA

为了获得导致两组差异的更可靠的代谢物信息，用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA来过滤与模型分类不相关的信号，共得到3个主成分(R2y=0.95，Q2=0.454)，得分图如图4所示，模型的解释率R2y和预测率Q2较大，表示(O)PLS-DA模型可靠。图显示两组样本分别处于第一主成分的两侧，表示两组样本(O)PLS-DA得分图上有显著的差异。

图4 AT1-AT2的 OPLS-DA的得分图Fig.4 OPLS-DA scores of fecal from group AT1-AT2

2.4 差异代谢物筛选

采用(O)PLS-DA第一主成分的VIP>1，结合P<0.05(T-test))的标准来寻找差异代谢物。通过与数据库比较质谱与色谱保留时间(RT)找到组间的差异代谢物(图5)。通过分析，将差异代谢物进行比对共概括出11种差异代谢物(表2)。

2.5 标记物代谢通路分析

将差异代谢物信息映射到KEGG 数据库，可以获得其富集到的KEGG 通路，KEGG富集结果如图5，对P-value最小的前10个通路作图，横坐标则为Pvalue取以e为底的负对数，-log(Pvalue)值越大，通路显著性越高。

表2 大杭粪便差异代谢物

Tab.2 Differential fecal metabolites in Dahang

图5 A-B组的差异代谢物富集通路Fig.5 Metabolite pathway in the A-B group

通过代谢分析，我们可以得出，行为训练引起的代谢物变化通路主要有嘧啶代谢、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成及分解，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢，半胱氨酸、蛋氨酸代谢。

3 讨论

行为训练作为一种丰容的方式对动物的行为方式有一定影响，如异常行为和与压力有关的行为降低，社会行为显著增加[4]。但行为训练对野生动物的生理作用并不太明确，皮质醇作为一种压力激素，与动物所受的压力状况有关，因此也用来评价环境丰容的有效性及与刻板行为的关系。但皮质醇还受到其他因素的影响，并不单一指示压力大小。在本研究中，我们初步探讨了采用GC-MC代谢组手段获得的与行为训练相关的差异代谢物质，且发现这些代谢物与氨基酸、脂质及核酸等多条通路有关。

在氨基酸代谢方面，丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸代谢均下调。众多研究表明，氨基酸代谢与动物压力水平密切相关[21-23]。特别是甘氨酸已被明确报道为一种抑制性神经递质，其含量减少可间接反映动物运动量增加，饮食增加或机体代谢提高[24]。

亮氨酸、异亮氨酸均为动物必需氨基酸，对机体具有重要的作用，对食欲、营养吸收及肝肾功能，氧化功能，调节蛋白质代谢，调节机体免疫功能。本研究结果显示，“大杭”的相关代谢通路上调变化，进一步说明行为训练可能提高了动物的运动倾向性，改善了其呆板行为的发生情况。该机制可能伴随行为训练提高了动物的新陈代谢，间接提高对其的有关合成代谢[25]。此外，半胱氨酸与动物心血管系统疾病和应激状态均有关。

核酸和能量代谢方面，本研究表明，丙二酸、嘧啶、肌苷、乳糖代谢在行为训练动物上得到显著增强，表现为其降解增强和粪便中相关产物含量的显著降低。该结果与谢亮[25]在应激猴模型中的研究结果相类似。研究报道，大鼠处于慢性压力状态下时，通过代谢组手段检测其血清代谢物含量时，其中的葡萄糖和肌酸的含量显著提高[26]。这可能由于压力状态减低了动物的糖代谢水平。特别是丙二酸为三羧酸循环的重要代谢产物，其水平显著降低可能是由于动物机体经过行为训练后，主动行为得到了强化，从而需要更多能量参与机体运动，最终提高了机体的有氧代谢过程，导致丙二酸等中间产物含量的降低。本研究结果提示，行为训练可能通过调控动物机体的能量代谢影响动物的行为。

本研究发现油酸和八碳脂肪酸酯的含量在训练动物上显著提高。上述两种物质均属于脂肪酸，研究表明，脂肪酸的含量可直接影响动物的行为状态。如Zhang等[26]的研究表明，饱和脂肪酸可影响胆固醇和脂蛋白水平，并间接区分动物行为状态。谢亮[25]研究发现，抑郁食蟹猴(Macacafascicularis)尿液代谢组分析中明显伴有脂肪酸代谢方面的紊乱和饱和脂肪酸水平的升高。本实验使用花生为强化物方法，花生为动物日常饲料，但因训练前，花生的供应是通过带壳花生的供应，动物对花生的利用率可能不高，存在浪费。而训练后，将这部分花生剥出，全部由训练员饲喂。因此可能相对增加了花生的摄入。从代谢物通路分析看出，通过行为训练后，最主要发生变化的代谢途径为相关的核酸代谢和蛋白质代谢，由于花生的代谢主要影响脂肪酸代谢，这可能也造成了代谢组中脂肪酸相关水平的提高，因此后续试验需要进一步验证该类脂肪酸和行为训练间的联系。