异丁酰辅酶A脱氢酶在便秘型肠易激综合征结肠黏膜的表达

张春燕，欧阳晶，孙 刚，张修礼，王巍峰，杨云生

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种功能性肠病，表现为反复发作的腹痛，与排便相关或伴随排便习惯改变，是消化系统常见的疾病之一。目前，IBS的发病机制还不完全清楚。我们在前期工作中发现异丁酰辅酶A脱氢酶(isobutyryl-CoA dehydrogenase，ICD)在腹泻型IBS患者结肠黏膜表达异常[1]。作为代谢相关酶ICD是哺乳动物乙烯还原酶家族成员之一，属于核编码的线粒体黄素酶家族成员，它以可溶性同源四聚体的形式存在于线粒体的基质中，涉及脂肪酸β-氧化以及亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸以及加压素的代谢[2]。对人类代谢组学的全基因组关联研究显示与β-氧化相关的许多代谢产物的正常变化具有很强的遗传相关性[3-4]。虽然β-氧化的极端异常导致短链或中链酰基肉碱脱氢酶缺乏易导致罕见病症，但β-氧化不太严重的异常与许多成人慢性病如2型糖尿病、肥胖、癌症、溃疡性结肠炎和神经退行性变有关[5]。ICD参与脂肪酸β-氧化，本研究进一步观察ICD在便秘型IBS(IBS with constipation，IBS-C)患者结肠黏膜的表达情况，以期为IBS发病机制提供进一步佐证。

1 材料和方法

1.1 一般资料 按照罗马Ⅲ诊断标准及罗马Ⅲ科研诊断标准，选择同时符合标准的IBS-C患者12例，男女各6例，年龄36～58(45.8±6.2)岁；选取健康对照者12例，男女各6例，年龄40～56(47.8±4.5岁)。均获得知情同意，并经中心伦理委员会批准。根据前期研究的方法钳取盲肠、乙状结肠黏膜组织[1]。

1.2 实验方法

1.2.1 结肠黏膜HE染色 各部位标本以10%甲醛固定、石蜡包埋、4 μm厚连续切片，按常规进行。病理切片的观察由2名病理学专家完成。

1.2.2 Western Blot方法检测 取20 μg所提取的蛋白经过12%的分离胶分离，上样量20 μg；一抗小鼠抗人ICD多克隆抗体(中国台湾Abnova公司，效价1∶100)，室温孵育1 h；二抗HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶10 000)室温孵育1 h。用ECL显色试剂对膜进行显色，结果分析以β-actin蛋白表达作为参照，应用BioRad公司提供的QuantityOne分析软件进行图像分析。测定目的显影条带和内参照β-actin(稀释度1∶2 000)的灰度值，结果以比值(样本灰度值/内参照灰度值)表示。

1.2.3 荧光定量PCR方法检测ICD mRNA的表达 将分离的组织悬液200 μL 加入1 mL TRIzol，提取RNA;按照逆转录试剂盒说明将RNA反转成cDNA。根据基因总长进行引物设计。ICD引物序列：上游5′-GTGCCTGGATGATTGATAG-3′，下游5′-TCTCCCTGTTTCTTAGCG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TTGTCAGCAATGCATCCTGCAC-3′，下游5′-ACAGCTTTCCAGAGGGGCCATC-3′，引物由上海英俊生物有限公司合成。

荧光定量PCR扩增反应体系如下:下游引物各0.25 μL,灭菌注射用水7.5 μL,荧光定量PCR Mix10 μL,cDNA 2 μL,反应总体系20 μL。反应条件:预变性95 ℃ 5 min;变性95 ℃ 30 s, 退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,反应40个循环；60 ℃ 30 s(收集溶解曲线),反应40个循环。扩增产物用实时定量PCR仪Bio-rad IQ5软件进行分析。

2 结果

2.1 Western Blot方法检测结肠黏膜ICD表达情况ICD在乙状结肠黏膜的表达IBS-C组低于健康对照组(P<0.05)；ICD在IBS-C组乙状结肠、盲肠的表达差异比较无统计学意义(P>0.05)；ICD在健康对照组乙状结肠、盲肠表达差异比较无统计学意义(P>0.05)。图1。

A：ICD在乙状结肠的表达；B：ICD在盲肠的表达(泳道1-3为健康对照组；泳道4-6为IBS-C组)；C：ICD/β-actin IBS-C组与健康对照组比较，*P<0.05

2.2 荧光定量PCR检测ICD mRNA的相对表达量与健康对照组比较，IBS-C组乙状结肠ICD mRNA的表达明显下调(P<0.05)；与健康对照组比较，IBS-C组盲肠ICD mRNA的表达差异比较无统计学意义(P>0.05，图2)。

与健康对照比较，*P<0.05

3 讨论

ICD是哺乳动物乙烯还原酶家族成员之一，属于核编码的线粒体黄素酶家族成员，它以可溶性同源四聚体的形式存在于线粒体的基质中，由N-末端α螺旋区域，α β片状区域以及另外C-末端的α螺旋区域组成，涉及脂肪酸β-氧化和亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、加压素的代谢[6]。ICD在代谢过程中催化脂酰辅酶A中间产物的α，β脱氢(作用)，在代谢支链氨基酸加压素的代谢中催化异丁酰辅酶A转化异丁烯酰基辅酶A，在亮氨酸的代谢中催化异戊酰辅酶A的脱氢作用[7]。

ICD的遗传缺陷导致异戊酸酸血症，ICD缺乏症是一种罕见的代谢性疾病，常在儿童期发病，其发病与体内编码ICD的基因发生突变有关[8]。1998年，Roe等[9]报道了首例ICD缺乏症。直到2002年，Nguyen等[10]首次报道病症的基础是在DNA水平的异常。大多数患者无症状仅在串联质谱法新生儿筛查时发现此病，常有报道经筛查出的患者没有给予任何治疗依然无任何症状[11]。蛋白结构和折叠研究已经发现与疾病相关的ACAD基因变异导致蛋白错折叠以及不稳定[12]。ACADS基因的突变分析揭示了突变R302Q(指的是在成熟蛋白质中的全长蛋白质对应的氨基酸280)的同合子性，使精氨酸被谷氨酰胺所代替，在体外能导致酶失活[10]。R302Q影响FAD辅助因子的作用以及ICD四聚体分子亚单位之间相互作用或FAD与四聚体亚单位间的作用[12]。

本研究通过Western Blot方法检测发现健康对照组及IBS-C患者结肠黏膜上皮细胞均有ICD的表达，ICD在IBS-C乙状结肠表达明显低于健康对照组的相应部位，但ICD在盲肠的表达差异比较无统计学意义。通过荧光定量PCR也进一步确认了IBS-C组乙状结肠的ICD mRNA表达下调。结肠黏膜ICD的表达下调提示亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸以及加压素代谢可能异常。ICD除了在先天性代谢性疾病的研究外，有关ICD与疾病的研究较少，Wollmer等[13]发现ICD基因多态性与散发型Alzheimer’s病有关。选择性剪接小鼠编码ICD的基因可导致线粒体缺陷和引起小鼠肝脏脂肪变性[14]。人肝脂肪变性与ICD的关系需进一步研究证实。亮氨酸、异亮氨酸及加压素等支链氨基酸对于正常细胞的生长和发育尤其重要，IBS结肠组织中这些氨基酸代谢异常，必然影响结肠上皮细胞正常的功能。ICD的表达减低是否也跟基因突变有关？是否会引起其上游代谢产物在结肠黏膜局部累积，是否存在氨基酸代谢异常，从而导致IBS患者的症状？我们在前期研究中发现糖代谢相关酶醛缩酶A在IBS结肠黏膜表达异常[15]。两者是否相互关联？与β-氧化的关系怎样？这些问题都有待于进一步研究。