MiR-138在脑胶质瘤患者血清表达的生物学效应及临床意义

袁红刚，李三梅

脑胶质瘤是颅内恶性肿瘤中最常见的一种[1]，世界卫生组织根据恶性程度将其分为4级：Ⅰ-Ⅱ级为低级别脑胶质瘤、Ⅲ-Ⅳ级为高级别脑胶质瘤[2]，其发病机制不明，迄今仍缺乏早期准确、客观、系统的诊断指标，患者死亡率高、存活期短。因此，进一步了解脑胶质瘤的发生发展，明确影响脑胶质瘤恶性程度的相关因子，寻找早期的诊治手段显得尤为重要。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一类内生的，长度约为18～24个核苷酸的非编码单链小RNA，其参与肿瘤发生、发展、转移的各个阶段[3]。有报道表明血清中游离miRNA被认为是有价值的肿瘤检测指标之一[4]。MiR-138是肿瘤中重要的调控因子，其在脑胶质瘤细胞与组织中低表达[5]，但其在脑胶质瘤患者血清中表达的变化国内外还没有文献报道。本研究拟通过实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)方法对脑胶质瘤患者及健康体检者血清中miR-138的表达水平进行检测，体外实验分析miR-138表达变化对脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨miR-138在脑胶质瘤发生发展中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究所有血清标本均来源于湖北省汉川市人民医院神经外科脑胶质瘤确诊患者及健康体检者，并按照标准流程进行样本收集，每组各60例，其中所有脑胶质瘤患者标本采集前均未接受放化疗或手术治疗，健康体检者各项检测指标均在正常参考范围内且体格及影像学检查均无异常，本研究所有纳入患者均已知情且获得本院医学伦理委员会同意。所有血清标本收集后均立即置于4℃离心机中，3 500 r/min离心10 min；分离血清后再置于4 ℃离心机中，12 000 r/min离心15 min。将最终获得的血清置于无RNA酶的Ep管中-80 ℃保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 血清RNA的提取及qRT-PCR检测 利用血清miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501，北京天根生化科技有限公司)，按照说明书中的标准操作流程分离提取血清标本中的miRNA。以miRNA为模板，通过cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific Inc，美国)进行逆转录，其具体反应体系(10 μL)：2 μL总RNA，3 μL超纯水，1 μL引物，充分混匀后67 ℃孵育5 min后置于冰上；加入0.5 μL逆转录酶，0.5 μL RNase抑制剂，1 μL dNTP以及2 μL逆转录缓冲液，充分混匀后按42 ℃ 50 min，80 ℃ 5 min体系进行逆转录。通过Maxima SYBR Green qPCR Kit试剂盒(Thermo Scientific Inc，美国)，采用qRT-PCR的方法对2组血清样本中的miR-138的表达水平进行检测。其反应体系(20 μL)：2 μL cDNA，6 μL超纯水，10 μL SYBR Green反应缓冲液，1 μL上游引物，1 μL下游引物；反应条件如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，共40个循环。所有检测结果均采用2-ΔΔCt的方法进行分析。反应中所使用引物序列设计如表1。

表1 miR-138以及内参U6引物序列

1.2.2 细胞培养及转染 人脑胶质瘤细胞系U251和U87购自中国科学院细胞库。用含10%胎牛血清(中国NCPC公司)、200 μg/mL链霉素(美国GIBCO公司)和200 U/mL青霉素的高糖DMEM培养基作常规培养，培养环境为5% CO2，室温37 ℃。miR-138 mimic(AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGTT)及miR-NC均由美国Invitrogen生物公司合成。参照Lipofectamine-2000转染试剂盒(美国Invitrogen生物公司)分别对2种脑胶质瘤细胞系转染miR-138 mimic和miR-NC，48 h后参照实验方法1.2.1测定细胞转染后miR-138表达水平的变化。

1.2.3 MTT实验检测细胞增殖 将分别转染miR-138 mimic及miR-NC的2种脑胶质瘤细胞接种于96孔板中(2×103/孔)，每孔200 μL，作常规培养。处理后，向第一孔中加入20 μL噻唑蓝溶液，37 ℃继续培养4 h后小心吸去上清，加入200 μL二甲基亚砜溶液，振荡10 min，在酶联免疫检测仪OD490nm处检测其吸光值并做好记录。按照上述方法，每24 h监测1次细胞增殖情况，共计5次。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 取对数生长期脑胶质瘤细胞，用含牛血清白蛋白的培养基重悬，调整细胞密度达到5×105/mL，制备细胞悬液。取细胞悬液100 μL置于Transwell小室中，并预先在下层小室中加入适量含有20%胎牛血清的细胞培养基。细胞培养24 h后，取出Transwell小室，弃去培养液，无钙磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗，甲醇固定30 min，然后用0.1%的结晶紫染液进行染色20 min，用棉签小心擦去小室上层细胞，再次PBS液冲洗，于显微镜下观察脑胶质瘤细胞迁移与侵袭。随机选择5个不同视野进行细胞计数(200×)，实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 脑胶质瘤患者和健康体检者血清中miR-138表达情况 通过qRT-PCR实验检测脑胶质瘤患者和健康体检者血清中miR-138表达，结果显示：血清中miR-138表达水平，与健康体检者(4.72±0.66)比较，脑胶质瘤患者(2.35±1.07)明显降低(t=14.60，P<0.01)，图1。随脑胶质瘤患者恶性程度的增加，miR-138表达量逐渐减少，且低级别脑胶质瘤与高级别脑胶质瘤患者血清miR-138表达差异比较具有统计学意义(t=15.22，P<0.05)，但低级别脑胶质瘤患者(Ⅰ与Ⅱ级)以及高级别脑胶质瘤患者(Ⅲ与Ⅳ级)之间相互差异比较无统计学意义(t低=0.13，P>0.05；t高=0.38，P>0.05)，表2。

与健康体检者比较，***P<0.01

表2 不同恶性程度脑胶质瘤患者miR-138相对表达量

注：与低级别胶质瘤Ⅱ级比较，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；与高级别胶质瘤Ⅲ级比较，△P>0.05，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 血清miR-138表达对脑胶质瘤诊断价值的ROC分析 通过ROC曲线(图2)评估血清miR-138诊断脑胶质瘤的灵敏度和特异性，结果发现：曲线下区域面积(area under curve,AUC)为0.75(95%置信区间为0.65～0.85，P=0.00)；根据约登指数确定诊断脑胶质瘤的miR-138临界阈值即截断值为2.19，其诊断脑胶质瘤的灵敏度为92%、特异性为52%。提示miR-138作为诊断脑胶质瘤的标志物具有较高的诊断效率。

图2 脑胶质瘤患者血清miR-138诊断价值的ROC曲线

2.3 转染miR-138 mimic与转染miR-NC脑胶质瘤细胞内miR-138表达 与转染miR-NC组比较，转染miR-138 mimic的2种脑胶质瘤细胞miR-138表达水平明显升高(tA=11.93，P<0.01；tB=10.53，P<0.01)。图3。

与miR-NC组比较，***P<0.01

2.4 MiR-138高表达对脑胶质瘤细胞增殖的影响 分别将miR-138 mimic或miR-NC转染至2种脑胶质瘤细胞后，通过MTT实验检测其增殖能力的改变，结果显示：过表达miR-138将明显抑制脑胶质瘤细胞的体外增殖能力。图4。

图4 MiR-138高表达对脑胶质瘤细胞增殖的影响

2.5 MiR-138高表达对脑胶质瘤细胞的侵袭、转移能力的影响 分别将miR-138 mimic或miR-NC转染至2种脑胶质瘤细胞后，通过Transwell实验检测2种脑胶质瘤细胞的迁移与侵袭能力变化。结果显示，转染miR-138 mimic组脑胶质瘤细胞体外迁移和侵袭能力均受到明显抑制。图5。

与miR-NC组相比，***P<0.01

3 讨论

脑胶质瘤是一种源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤接近一半。脑胶质瘤早期症状不明显，发现时大多已经侵袭至重要功能区，导致手术无法完全切除，加上对放化疗效果不明显，造成脑胶质瘤患者，尤其是恶性胶质瘤患者生存率非常低，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第三位[6]。因此，早期诊断对于脑胶质瘤的治疗及预后有着非常重要的作用。

MiRNA是非编码RNA中的成员，近年来研究发现miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要的作用，具有极大临床诊断价值[7]。Lu等[8]研究发现miR-573表达水平的下调将促进胃癌的发生，可作为一种肿瘤标志物应用于胃癌的早期诊断；李涛等[9]研究发现肝癌血清miRNA-200c表达变化促进肝癌的发生、发展，并与患者预后相关；miRNA-141是潜在的前列腺癌早期诊断标志物[10]；miRNA-21、miRNA-34a参与了宫颈癌的发生发展，且两者对宫颈癌的早期诊断具有一定的预测效能等[11]。因此，对不同肿瘤特异性miRNA的检测将有利于肿瘤的早期诊断，从而及时采取措施来改善肿瘤患者的预后。

MiR-138是近年来新发现的一类具有肿瘤调控作用的miRNA，在多种恶性肿瘤中呈现低表达[12-13]。因此，miR-138在肿瘤形成过程中通常发挥抑癌基因的作用。Stojcheva等[14]研究表明，miR-138能通过靶向抑制细胞凋亡蛋白BIM从而抑制自噬介导替莫唑胺化疗对胶质瘤细胞的耐药；王震等[5]研究表明miR-138通过下调hTERT蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，是新的胶质瘤抑癌因子。但是这些研究都集中在细胞与组织上miR-138表达的变化，作为肿瘤良好标志物检测项目的外周血液中miRNA表达是否变化还未见报道。本研究发现脑胶质瘤患者血清miR-138呈现低表达，且随着脑胶质瘤的恶性程度增加，血清miR-138表达量逐渐减少。原发癌组织与血清中miRNA表达水平具有一致性[15]，既然脑胶质瘤患者组织与细胞miR-138呈现低表达，那么势必导致血清miR-138呈现同样变化。本研究利用ROC曲线对脑胶质瘤的诊断效率进行评估，AUC为0.75，结果呈现出较好的诊断效率；通过约登指数确定最佳截断值为2.19，其诊断脑胶质瘤的敏感性和特异性分别为92%和52%。最佳截断值的确定，为miR-138应用于临床脑胶质瘤的诊断提供了实验依据。通过体外细胞实验发现miR-138过表达抑制脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭和转移，提示血清miR-138低表达引起脑胶质瘤产生及恶性程度增加可能是因为肿瘤细胞增殖和侵袭作用加强所引起的。

脑胶质瘤患者血清miR-138表达下调与脑胶质瘤发生及恶性程度有关，其机制可能是因为脑胶质瘤细胞增殖和侵袭作用加强。血清miR-138测定有望成为诊断脑胶质瘤的分子生物标志物及特异性治疗的靶点，其作用机制还需要进一步研究。