程序性死亡配体1的转运与稳定性

邹媚，林佳，王清水

福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350117

机体在正常情况下，免疫系统会通过相关共抑制和共刺激受体及其配体（被称为免疫检查点）来保护宿主免受自身免疫、过敏和传染病的侵袭[1-2]。临床数据表明，肿瘤利用许多类似途径作为重要的开关来逃避抗肿瘤免疫反应，并最终发展、传播和转移[1,3]。在生理免疫稳态中细胞程序性死亡受体1（programmed death receptor-1，PD-1）和程序性死亡配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）轴在免疫通路中发挥关键作用[4]，PDL1在黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肾癌细胞中的高表达是癌细胞逃避免疫系统的重要途径[5]。肿瘤发生过程中PD-1的主要配体为PD-L1，一旦肿瘤细胞膜表面编程蛋白PD-L1高于正常组织细胞，与被激活的T细胞膜受体PD-1识别结合，传达抑制免疫信号后，导致T淋巴细胞数量减少、T细胞活性削弱、免疫因子与免疫细胞生成及活性下调等免疫应答，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸[6]。

PD-L1蛋白转运调控研究进展表明，蛋白激酶D（PKD）通过诱导脂酰肌醇4激酶（PI4K）和磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（PIP5K）的磷酸化来调节PD-L1的转运[7-9]，顺铂通过诱导细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化介导膜表面蛋白PDL1的上调[10]，依赖核因子κB（NF-κB）信号通路的CD40诱导PD-L1向细胞表面转运[11]；人类趋化因子CMTM6能与PD-L1结合并能维持其在细胞表面的稳定表达[12]；亨廷顿相互作用蛋白1相关蛋白（HIP1R）靶向PD-L1溶酶体降解，从而调控T细胞介导的肿瘤杀伤作用[13]；二甲双胍导致PDL1翻译后修饰异常，进而阻断其从内质网到高尔基体的转运[14]；PD-L1的2种不同剪接形式决定了后期在膜或胞质区的定位[15]，并且能以可溶性和外泌体的形式游离于胞外[16-17]。这些因子都可能成为潜在的肿瘤免疫治疗手段。在此，我们简要综述PD-L1的转运及维持稳定性的相关因素。

1 PD-1与PD-L1

PD-1拥有288个氨基酸残基，属于Ⅰ型跨膜蛋白，作为凋亡相关分子在凋亡的免疫细胞系中被发现，主要表达于抗原性记忆T细胞，少量表达于B细胞、活化自然杀伤细胞（NK细胞）和单核细胞[18]。PD-1由胞外区免疫球蛋白超家族结构域及胞质区免疫受体酪氨酸开关基序（ITSM）和免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）组成，并含有ITSM和ITIM的磷酸化位点[1,19]。PD-L1拥有290个氨基酸残基，属于Ⅰ型跨膜蛋白，且对T细胞有抑制作用，1999年由陈列平等发现，在肿瘤细胞中的表达高于正常组织细胞[20-21]。成熟的PD-L1包含跨膜结构域、Ig-C和Ig-V样的胞外结构域，以及在不同物种中高度保守且不含信号肽的胞质结构域[22-23]。研究发现该蛋白以外泌体的形式大量存在于肿瘤细胞外，远高于正常组织细胞，并能够远程影响机体的免疫状态[24-25]，表明肿瘤细胞中PD-L1这一项免疫检查点是肿瘤实现免疫逃逸的主要路线。

当肿瘤细胞膜蛋白中PD-L1与T淋巴细胞中PD-1的胞外结构域相互识别时，T细胞募集与酪氨酸蛋白激酶Src同源的磷酸酶SHP-1和SHP-2，诱导PD-1胞内结构域中的ITIM和ITSM进行磷酸化，进一步抑制T细胞受体（TCR）下游信号通路的传导，使T淋巴细胞功能发生障碍、耗竭、凋亡和免疫中和[4,26]，生成高度浸润的调节性T细胞（Treg）及细胞毒性T细胞（CD8+）抑制效应免疫反应，并让机体处于肿瘤细胞杀伤抵抗现状[14,23,27]。

2 PD-L1的转运

2.1 蛋白的分选和转运

传统意义上细胞核编码的蛋白质分选有2条转运途径：共翻译转运和后翻译转运[28]。共翻译转运途径是当蛋白质在游离核糖体合成延伸几十个氨基酸之后，前端信号肽与其结合的信号识别颗粒（SRP）共同引导新生肽边合成边转至糙面内质网并定位于内质网，而后通过转运膜泡将肽链转移到高尔基体中进行加工、包装，形成成熟的蛋白质后分选到溶酶体、细胞膜或以可溶性蛋白的形式分泌到胞外。后翻译途径是蛋白质在细胞质基质中游离的核糖体上完成多肽的合成和修饰，直接转运至细胞内的细胞器，成为细胞质中骨架蛋白或可溶性驻留蛋白[29-30]。PD-L1属于共翻译转运的过程。

2.2 调控PD-L1运输的关键因素

由于PD-L1高表达于肿瘤细胞膜表面，并利用PD-1/PD-L1轴的免疫检查点负向调控机体免疫作用[31]，因此了解影响其转运的相关因素是必要的。Poly（I∶C）是一种可增强免疫治疗的合成型dsRNA模拟物，Varthanan等发现，用Poly（I∶C）预处理树突状细胞（DCs）后重组 CD40（rCD40L）导致膜表面PD-L1水平增加而胞内无明显差异，与此同时rCD40L诱导的PD-L1转运可被NF-κB信号通路抑制剂南蛇藤醇（celastrol）抑制[11]，表明Poly（I∶C）处理DCs后，rCD40L诱导膜表面PD-L1的转运依赖于NF-κB。有趣的是，在用蒽环类药物阿霉素处理乳腺癌细胞时，检测到膜表面PDL1蛋白水平明显下调而细胞核中PD-L1上调。此过程伴随磷酸化AKT蛋白（p-AKT）的易位，即细胞膜和细胞质中p-AKT下降，细胞核中p-AKT上升[32]，表明PD-L1重新分布到细胞核中的过程与p-AKT转位到细胞核有关。PI3K/AKT通路的抑制作用可消除阿霉素介导的PD-L1的核上调，表明PI3K/AKT通路参与了PD-L1的核上调[32-33]。

肿瘤的微环境中，炎症细胞分泌的γ干扰素（IFN-γ）是主要刺激肿瘤PD-L1表达的一种细胞因子。用IFN-γ处理人口腔鳞状细胞癌会上调PKD2及膜表面PD-L1的表达，并存在时间和剂量依赖性[34]。当PKD的化学抑制剂抑制或采用shRNA/siRNA干扰PKD2，IFN-γ诱导表达效果明显下降[34]。已有研究表明PKD介导PI4K和PIP5K的磷酸化并加强蛋白之间膜质运输，且PI4K与PIP5K也参与调解蛋白进入特定的膜位置[7-9]，说明依赖IFN-γ的PD-L1转运中PKD轴信号通路具有调节作用。另外，PKD阻滞剂的加入能削弱紫杉醇诱导宫颈癌细胞TC-1表面PD-L1的表达[35]，这与PKD参与IFN-γ诱导的PD-L1转运相似。此外，二甲双胍作为Ⅱ型糖尿病口服药物能激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK），直接导致PD-L1 S195的磷酸化，诱导PD-L1异常糖基化并导致内质网相关蛋白（ERAD）降解，进而阻断PD-L1从内质网到高尔基体的正常转运[14]。

依托泊苷、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂和尼美舒利等多种试剂都可调控肿瘤细胞膜表面PD-L1的表达[35-38]。据报道，顺铂通过调节ERK1/2的磷酸化来上调肝癌细胞株H22膜表面PD-L1的表达，且在其他肿瘤细胞如HNSCC和宫颈癌中发现顺铂亦能上调膜表面PD-L1的表达[10]。5-Fu处理结直肠癌细胞HCT-116可能调节PD-L1蛋白的转运，导致膜和胞内的PD-L1表达差异[36]。相反地，尼美舒利处理乳腺癌细胞后，下调了膜表面的PD-L1蛋白表达[37]。这些试剂对肿瘤微环境中PD-L1蛋白具体转运信号通路的作用有待进一步探究。

PD-L1不同的剪接体会影响其在细胞内的转运和分布。在外周血单核细胞（PBMC）中发现一个PD-L1新型mRNA剪接变体，主要定位于细胞内，传统的同工型PD-L1成熟后主要表达于血浆表面，2种剪接变体有明确的定位模式[15]。证明了PD-L1蛋白结构中Ig-V结构域对于靶向细胞表面的转运至关重要。

2.3 PD-L1的亚细胞转运

对于肿瘤细胞而言，治疗难点在于PD-L1可以源源不断地从细胞中产生，最近研究表明，大量PD-L1以外泌体和可溶性蛋白形式存在[16-17]。外泌体在多种肿瘤细胞胞外具有丰富的生物活性，提示外泌体可能成为半侵袭性生物标志。在前列腺癌模型中，外泌体PD-L1具有抑制抗肿瘤免疫反应系统的作用，其阻滞促进引流淋巴结T细胞的活性，诱导全身抗肿瘤免疫和记忆[25]。值得注意的是，胞外囊泡可以携带活性PD-L1分泌到胞外，协助肿瘤的免疫逃逸，免受PD-L1抑制剂的追杀。Zhou等在黑色素瘤模型中鉴定出4个缺少跨膜结构域的可溶分泌型PD-L1剪接体，可溶性PD-L1中大部分能够抑制免疫T细胞的活性，在药物刺激诱导下能够促进表达[39]。在结合单抗PD-L1耐药治疗试验中检测到PD-L1的2个剪接变体v229/v242能够竞争性结合抗体并有效中和抗体活性[24]。这些结果有力地说明了肿瘤聪明地躲开了很多治疗方法。蛋白水平的定量分析只提供了复杂的转运调控中的一个契点，寻找新型有效阻断PD-L1蛋白转运的相关试剂仍然具有重大意义。

3 PD-L1的稳定性

研究表明，除了蛋白的糖基化和泛素化修饰外，PD-L1结合蛋白也会影响PD-L1的稳定性[40]。最近被鉴定为PD-L1正调控因子的CMTM6是一种Ⅲ型跨膜蛋白，通过辅助性伴侣蛋白STUB1阻止PD-L1的多聚泛素化，与PD-L1共定位以竞争性回收至内体，防止溶酶体导致PD-L1降解，提高PD-L1在细胞内的稳定性[41]。CMTM4具有与CMTM6相似的功能[12]。Sigmal是另一种能与PDL1结合的蛋白，它是某种特定配体调控的完整支架蛋白，用以维持细胞蛋白与脂质的稳定，故其小分子抑制剂能够通过选择性自噬诱导PD-L1降解抑制乳腺癌和前列腺癌细胞[42]。

PD-L1蛋白降解的具体调控机制仍不清楚，而后发现的HIP1R揭示了PD-L1溶酶体降解途径的相关机制。HIP1R是参与囊泡运输的F-肌动蛋白和网格蛋白的结合蛋白，在多种肿瘤细胞中敲低HIP1R均表现为上调PD-L1表达。其作为PD-L1溶酶体降解的负性调控分子，依赖于HIP1R中的PD-L1结合序列和分选序列，能通过与AP复合物结合将PD-L1运输到溶酶体表面，内吞体分选转运复合体（ESCRT）相关蛋白ALIX作用后将PD-L1运输至多囊体和溶酶体中进行降解。经验证，融合了结合序列和分选序列的多肽PD-LYLSO可以有效介导靶标蛋白PD-L1的降解[13]。蛋白酶体抑制剂MG132[43]和溶酶体抑制剂氯喹[44]都可增加PD-L1蛋白的表达，说明PD-L1的降解途径包括蛋白酶体降解和溶酶体降解。迄今仍不清楚在不同的癌症中哪种途径占优势。

4 结语

癌症细胞中PD-L1的转运通路还未明晰，但我们知道它不仅存在于肿瘤细胞表面，还存在于高尔基体、循环内体和微囊泡中，胞内也不断地为胞外PD-L1进行补充，都能行使正常的促癌生物功能。这或许是造成目前抗体药物对不同癌症疗效受限甚至耐药的原因。如果能确定PD-L1活性变构并挑选与PD-L1相互作用的蛋白质，如CMTM4/6、Sigmal和HIP1R等表征后进行充分的蛋白分析，可开发合理的阻断肽或化合物设计，与PD-L1/PD-1单抗药物双结合共同治疗癌症，不失为一种新的治疗手段。目前发现有效而具体地靶向癌细胞的PD-L1仍然是一个棘手的问题。