Raf激酶抑制剂蛋白与肿瘤干细胞相关因子的相互作用

赵楠，李玉花，杨雪,张俐佳，刘岩

1.黑龙江中医药大学 附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040

Raf激酶抑制剂蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的成员，其既能抑制激活丝裂原胞外信号调节激酶Raf，又能活化B细胞途径的核因子κ轻链。在恶性肿瘤中，RKIP对药物/免疫介导的细胞凋亡具有转移抑制和化学免疫增敏作用，且恶性肿瘤大多数表现出RKIP的低水平或无水平。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞，既具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化潜能。虽然肿瘤干细胞在肿瘤组织中只占极少的一部分，但却在肿瘤发生发展过程中起着决定性的作用。而这些干细胞大多数处于静止状态，能够逃避或抵抗化疗药物的毒性作用，是肿瘤复发和转移的根源。肿瘤中维持干细胞自我更新和增殖机制的一些调控因子的研究是肿瘤干细胞研究的重要内容，如Oct4、KLF4、Sox2和Nanog是目前公认的干细胞调控因子。因为RKIP在肿瘤耐药和转移中的作用，它们的活性在一定程度上与上述几种肿瘤干细胞转录因子介导的活性形成了对比。研究表明，RKIP与肿瘤干细胞相关因子如Oct4、KLF4、Sox2和Nanog在信号通路中存在复杂的相互作用，通过相互作用分析认为RKIP的表达水平可能参与了肿瘤干细胞表型的调控。如果上述交互作用存在，说明RKIP的诱导可能在CSC中起到转移抑制和化学免疫增敏作用，将为开发新的药物来诱导RKIP的表达，从而直接抑制调节CSC表型的转录因子，并使整个肿瘤对各种化学免疫治疗方式敏感带来新的希望。

1 RKIP概述

磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）被发现可以通过直接与Raf-1结合来抑制Raf-1/有丝分裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶（Raf/MEK/ERK）途径。PEBP1被重新命名为Raf激酶抑制剂蛋白，它是一种表达于多种生物体和组织中的调节分子，参与多种细胞内信号网络调控。

自发现以来，RKIP已被证明与鸦片类吗啡-6-葡萄糖醛酸苷等疏水性小配体结合。RKIP是第一种内源性蛋白质，通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用与Raf-1结合，抑制有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的级联。RKIP对信号通路的表达和强度的复杂控制表明它在许多细胞过程中的重要性，包括细胞周期、细胞转化、凋亡、心肌细胞收缩性、肿瘤进展和转移抑制[1-2]，尤其是在前列腺癌和乳腺癌中。在前列腺癌基因小鼠模型中，RKIP表达的缺失被发现可以加速肿瘤的进展和转移[3]。

人类RKIP基因位于12q24.23号染色体，由4个外显子和1个独立的主转录本组成。RKIP蛋白相对分子质量为23 000，含有187个氨基酸残基，在人类、牛和植物中均有表达。RKIP的三级球状结构包含一个疏水空腔（作为配体结合囊）和一个与磷脂酰乙醇胺结合的PE结合域，配体结合域也参与了Raf/MEK结合。

2 RKIP在肿瘤组织中的表达

RKIP表达水平的降低通常与多种肿瘤类型和肿瘤发生有关，RKIP的丢失通常会加速肿瘤的进展，而RKIP的过表达通常会阻碍肿瘤的发生和转移。在B细胞淋巴瘤中，RKIP可以降低活化的Raf的反应，RKIP表达的增加与抗CD20治疗诱导的B细胞凋亡的增加有关。此外，高水平的RKIP与B细胞淋巴瘤细胞Ramos对嵌合抗CD20小鼠/人单克隆抗体引起的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）的敏感性有很强的相关性。因此，RKIP与B细胞淋巴瘤组织对凋亡的敏感性有关[4]。

与正常细胞相比，膀胱移行细胞癌（TCC）中RKIP mRNA的转录调控降低。RKIP表达的翻译调控决定了肿瘤进展和淋巴管浸润的程度。对膀胱癌的进一步研究表明，RKIP水平的降低可能与浸润性表型相关。在脑癌中，RKIP表达下调主要见于胶质瘤和胶质母细胞瘤[5]。RKIP因其标志着恶性进展因此在脑癌中作为一种生物标志物发挥作用，而RKIP表达的减少与细胞迁移和转移有关。

在乳腺癌中，浸润性癌细胞中RKIP表达下调，而淋巴结转移癌细胞中RKIP完全丧失。研究表明RKIP是一种转移抑制因子[6～7]，RKIP表达的减少促进转移，RKIP表达的增加抑制了MDAMB-231乳腺癌细胞的转移和侵袭能力[8]。另一项发现显示RKIP是基质基因的调节因子，可以阻止乳腺癌骨转移。RKIP上调也可诱导化疗中癌细胞凋亡。

与正常黏膜相比，RKIP在结直肠癌组织中的表达下调，在转移性结直肠癌细胞中的表达进一步降低，RKIP的降低也与结直肠癌的转移和血管侵犯有关。RKIP在大多数食管鳞状细胞癌患者中表达减少[9]，并与预后不良相关[10]。RKIP启动子高甲基化的发现表明RKIP在基因水平上的转录活性有助于RKIP表达的减少。与正常组织相比，RKIP在胃癌中的表达下调[11～13]，在胃癌患者淋巴结转移中的表达进一步下调，这证实了RKIP作为转移抑制蛋白的作用。

与正常组织表达相比，卵巢癌细胞RKIP水平明显降低，侵袭能力增强，提示RKIP可能是一种转移抑制基因。RKIP表达上调抑制卵巢癌的转移和进展。在宫颈癌中也发现RKIP表达降低，与顺铂化疗中转移潜能增加、肿瘤血管化能力增强和细胞凋亡抵抗有关[14]。RKIP在肝细胞癌中表达下调，很可能是甲基化导致的[15]。RKIP上调抑制肝细胞癌肿瘤的生长和细胞迁移。RKIP mRNA在大多数非小细胞肺癌组织中的表达减少，在转移组织中的表达进一步减少。RKIP和E-钙黏蛋白的表达降低可促进非小细胞肺癌的侵袭和转移[16]。

鼻咽癌组织中RKIP的表达水平明显低于正常鼻咽上皮组织。与非转移性前列腺癌组织相比，RKIP在大多数原发性前列腺癌细胞中的表达显著降低，甚至在转移性组织中的表达进一步降低。RKIP下调与大量肾癌及预后不良的病例有关[17]。少数临床前研究表明，RKIP表达降低与甲状腺癌进展有关，而RKIP表达上调与肿瘤的抑制有关，总体而言，RKIP表达是淋巴结转移的重要标志。临床前研究表明RKIP是一个具有统计学意义的重要生物标志物。所有证据都表明RKIP是一种转移抑制因子和预后不良的标志物。

3 RKIP与肿瘤干细胞因子之间的相互作用

3.1 RKIP与Oct4

Oct4作为POU5F1基因编码的转录因子，对Sox2和Nanog等其他转录因子起着积极的调节作用。Oct4作为维持胚胎干细胞状态的转录因子家族的重要组成部分是不可替代的，因为它不能被来自同一蛋白家族的任何成员所取代[18]。Oct4的主要功能之一是维持多能干细胞的状态[19]。在胚胎干细胞中通过某些转录因子的上调可能与肿瘤干细胞（包括Oct4）的多能性维持、DNA的修复、复制和稳定之间可能存在联系[20]。Oct4敲除表达实验中，Sox2和Nanog显著降低，这支持了这3种转录因子协同工作以保持人类胚胎干细胞（hESCs）中细胞处于多能性细胞状态的理论[21]。在激活Oct4基因表达的诱导物中，FoxD3、Nanog、Lin28诱导的激活以及Oct4本身起着控制Oct4水平的作用。在负反馈回路中，Oct4的表达增加会导致Oct4与Nanog启动子结合，抑制Nanog基因的转录，从而降低Oct4的表达。

RKIP通过诱导miRNA结合蛋白Lin28参与Oct4的功能和调控。RKIP抑制Lin28的表达，进而上调参与CSC状态激活的Let-7 miRNA。另一方面，Lin28也诱导Oct4的表达。因此，RKIP可能通过Lin28间接下调Oct4的表达。Lin28的表达减少，导致Oct4介入了分化的诱导，与Oct4作为“多潜能守门人”的角色保持一致。Oct4是一种保持平衡的精巧蛋白，Oct4的表达水平降低或增加50%可以诱导胚胎或滋养外胚层谱系的分化，影响正常细胞表型状态的维持。

通过与Ras的靶分子Raf-1结合抑制MAPK通路，而过表达的Stk40细胞中Ras表达增加。此外，Stk40可以通过Rcn2诱导ERK的活化，但具体机制尚不清楚。除了上述机制外，还可能存在Oct4、白血病抑制因子（LIF）/Stat3与另一个核心转录因子在类CSC状态细胞多能性调控的KLF4之间交叉的信号通路。因此，RKIP在Stat3通路中的作用可能提示了RKIP与Oct4之间的串扰通路机制，也可能是RKIP与KLF4之间的串扰通路机制。

3.2 RKIP与KLF4

KLF4是一种锌指蛋白转录因子，通过上调p21的转录并抑制细胞周期蛋白D1来抑制细胞生长。KLF4具有多种功能，包括在乳腺癌细胞中作为钙黏蛋白的增强子，在前列腺癌细胞中作为Slug/Snail2的抑制子。其主要作用是通过将KLF4与miRNA-7（miR-7）基因中可能的2 个 3′非翻译区域中的结合，作为miR-7的底物。研究发现，下调KLF4的表达可以抑制乳腺癌细胞中CSC向脑转移，而不是向骨转移。同时也发现miR-7的表达与KLF4的表达呈负相关，其中miR-7的上调导致KLF4的表达下降[22]。

KLF4与RKIP之间不直接相互作用，而是通过调节MAPK通路中的Oct4/Sox2/KLF4复合物间接相互作用。RKIP的表达与Lin28和Let-7的表达导致Oct4表达下调有关，为了维持细胞的多能性，Oct4和Sox2结合在一起形成异源二聚体，然后锁住KLF4的C端区域的不同结合位点，Oct4/Sox2/KLF4复合物将与Nanog启动子结合，转录允许细胞多能性转变和维持的基因。

此外，在Oct4、KLF4和Nanog存在下，Let-7的表达促进了CSC从诱导多能干细胞状态向分化的过程[23]。RKIP被认为是一种转移抑制因子和入侵表型的抑制剂。RKIP、Let-7、KLF4的表达结合可以上调CSC的分化，降低CSC的增殖，降低CSC的总可用频率。

RKIP与KLF4的一个联系是eHSP90与MAPK通路的联系。KLF4调节细胞内伴侣分子HSP90，HSP90参与重要信号分子如Raf-1的正确折叠。KLF4与RKIP之间的另一个联系可能涉及p53和p21的调节。已知RKIP诱导p53介导的细胞凋亡并抑制肿瘤转移，而KLF4上调依赖于p53的p21表达[24～25]。

3.3 RKIP与Sox2

Sox2被认为是一种致癌转录因子，其调节受Oct4的影响。Sox2可能是肺癌和食管鳞癌中细胞去分化过程中恢复多能干细胞状态的重要组成部分，但对胚胎干细胞的维持并不重要。Sox2的主要作用之一是通过Sox2抵消Sox3的表达来进行hESCs的自我更新。如果同时删除Sox2和Sox3，则丧失了自我更新和细胞分化能力。然而，Sox2的缺失导致了Sox3的表达，而在hESCs中Sox3的表达较低，但hESCs的自我更新能力是完整的[26]。

此外，翻译后修饰可以极大地影响Sox2的活性。研究发现，Sox2的类泛素化修饰阻碍了其与DNA的结合能力，而Oct4的类泛素化修饰则起到相反的作用，有助于与DNA的结合亲和力。研究发现在Lys75残基处抑制Sox2的乙酰化可阻止Sox2的核易位，并继续导致Sox2靶基因的高乙酰化表达。此外，Sox2乙酰化的上调通过泛素化和蛋白酶体降解降低了Sox2的表达，这表明Sox2乙酰化是Sox2功能的主要调节因子。

RKIP介导的Sox2调节是通过抑制Oct4间接实现的。当RKIP抑制MAPK通路时，也抑制ERK的激活。因此，Myc被抑制，它通过RKIP介导的Let-7上调来抑制Lin28的表达，Let-7是一种阻断Lin28活化的miRNA。最后，事件的级联抑制了Oct4的表达。Oct4和Sox2相互作用形成一个异二聚体复合物，与KLF4结合到Nanog启动子上，激活Nanog基因表达。值得注意的是，Sox2即使不与Oct4形成异二聚体复合物，也能与Nanog基因结合这种单体相互作用可以通过色氨酸和酪氨酸残基堆积来调节胚胎干细胞的自我更新。

3.4 RKIP与Nanog

作为一种转录因子，Nanog通过调节Oct4、Sox2、KLF4和自身的表达，在多能性和胚胎干细胞中发挥多方面的作用[27]。Nanog蛋白含305个氨基酸残基，它含有一个DNA结合区、一个同源框结构域和C端富含色氨酸的区域[28]。Nanog的调节可以通过多种途径进行，如与MAPK途径和Lin28-Let-7级联的间接联系以及与LIF-STAT-3途径的直接联系。Nanog的转录表达受多种CSC相关转录因子的复合物调控，包括Oct4、Sox2、KLF4、Nanog本身和其他因子。Oct4/Sox2异二聚体直接与Nanog基因结合以增加其表达。因此，Oct4、Sox2和Nanog的过度表达与肿瘤的发生有关[29]。这些转录因子的微妙平衡影响着细胞的命运和干细胞的表型。

Nanog被认为是CSC状态类型的关键诱导因子之一，因为它在维持多能性方面具有潜在的作用，并且是细胞凋亡和细胞自我更新的诱导因子。Oct4和Nanog的协同作用被认为是干细胞表型的诱导因子，这在以肝细胞癌为基础的干细胞特性研究及上皮细胞-间充质转化（EMT）的促进作用研究中被证实[30]。

RKIP可能通过多种途径间接介导CSC中Nanog的表达。上调Raf-1/MEK/ERK通路可诱导Nanog在Ser52位置磷酸化，提示MAPK通路可能影响与肿瘤干细胞和胚胎干细胞自我更新特性相关的通路。Oct4与Nanog之间的密切关系表现为RKIP通过2个相关途径间接调控Oct4，从而也间接影响Nanog的表达。

RKIP的正常功能是抑制Raf-1/MEK/ERK信号级联，但当RKIP被抑制时，ERK可以使已与Lin28启动子结合的Myc转录因子磷酸化并上调其基因产物，进而激活Oct4的表达。Oct4通常与Sox2形成异源二聚体与Nanog启动子结合，诱导Nanog表达，但由于RKIP的抑制作用，可以有效阻断Oct4及其下游靶点Nanog的表达。

RKIP介导的Nanog调控的另一个潜在途径来自p53，一种肿瘤抑制产物，与小鼠胚胎干细胞的Nanog启动子的结合。当p53对DNA损伤响应时，它可能与2个一致的结合基序结合，这2个基序诱导Nanog的抑制表达以修复遗传损伤。

4 结语

RKIP和CSC研究的下一步是寻找可能的治疗方法投入临床应用。关于CSC的假设是它们的存在支持并驱动着各种肿瘤的恶性程度。在评估与CSC表型相关的转录因子的普遍过表达水平后，新的治疗干预可能利用多潜能相关途径来阻止或阻碍CSC的生长。新的治疗靶点可以通过抑制或下调Oct4、Sox2、KLF4或与NF-κB相关的因子的表达而发挥作用。

研究表明，Oct4和Sox2相关的干细胞样特征与恶性肿瘤的临床意义之间可能存在相关性。Oct4和Sox2在宫颈癌中与患者预后不良、Oct4高表达和Sox2丢失之间的相关性显而易见[31]。然而，很难确定Sox2表达的确切结果，因为在肺癌中Sox2的高表达与患者的低生存率相关，而在食管鳞癌中Sox2的低表达与预后不良相关[32]。另一项研究发现，沉默Sox2可以挽救癌症药物他莫西芬的疗效，他莫西芬被用作治疗乳腺癌的内分泌疗法。乳腺癌细胞普遍对他莫昔芬耐药，它们表达高水平的Sox2，因此治疗也变得更加困难。Sox2在耐药肿瘤细胞中的过度表达提示Sox2参与了CSC的Wnt信号转导[33]。通过下调Sox2的表达，Wnt信号也降低，从而使耐药细胞对他莫昔芬重新敏感[34]。目前尚在进行的临床试验正在进一步研究不同治疗药物对CSC及其各自恶性肿瘤的影响。通过了解CSC相关转录因子在诱导多潜能和肿瘤发生中的作用，有可能选择性地靶向这些途径并产生治疗癌症的方法。目前尚不清楚这些疗法能在多大程度上通过与CSC相关的途径治疗癌症，还需要通过进一步的研究和临床试验来确定。