胶体金的疫苗递送及佐剂效应研究进展

张义浜，杨昱华

1.江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013；2.镇江市第四人民医院，江苏 镇江 212000

纳米颗粒，由于其尺寸与细胞主要组分和蛋白接近，容易通过内吞机制进入活细胞，在生物医学领域中得到广泛研究与应用[1]。胶体金因其尺寸处于纳米级，更多地被称为纳米金或金纳米颗粒（gold nanoparticles，GNPs）。其具有形状和粒径可控、易于表面改性和修饰等优点，并且有良好的生物相容性，被认为是一类具有潜力的疫苗递送载体。本文拟就胶体金在疫苗递送及其佐剂效应方面，尤其在无针化免疫方面的应用研究进展做简要综述。

1 胶体金作为疫苗载体及其佐剂效应

研究表明，胶体金能促进抗原特异性抗体的产生，具有免疫佐剂效应，被用于设计包括抗肿瘤以及多种传染性疾病的预防性疫苗。

2016年，Dakterzada等[2]报道了胶体金与铜绿假单胞菌鞭毛蛋白部分肽段的结合，评价了其对铜绿假单胞菌的免疫佐剂效果，表明胶体金能产生与弗氏佐剂相似的细胞免疫反应，起到杀菌效果。Wang等[3]也证明胶体金作为免疫佐剂，相较于弗氏佐剂能诱导产生更高滴度的特异性抗体。

另有研究发现，当胶体金和其他免疫佐剂联合使用时，可显著增强免疫效果。PfMSP-119是抑制疟疾侵袭抗体的靶点，但即使在有铝佐剂存在的条件下，其免疫原性仍然较弱。Parween等[4]采用胶体金和氢氧化铝凝胶共同作为PfMSP-119抗原的免疫佐剂，结果比单用铝佐剂组的血清抗体滴度增加了约10倍。同样，将鼠疫杆菌F1抗原与胶体金联合铝凝胶制剂，比单用铝凝胶制剂产生更强的体液免疫效果，特异性抗体滴度水平不仅更高而且持续时间更长[5]。

Wang等[6]发现与单用CpG寡脱氧核苷酸相比，CpG与胶体金联用能使乙肝核心蛋白（HBc）的特异性抗体滴度、CD4+和CD8+T细胞数、白细胞介素4（IL-4）和干扰素γ（IFN-γ）的表达水平显著增加。Dykman等[7]的研究也支持这一观点。胶体金被认为能促进树突状细胞对抗原的提呈，促进细胞毒性T淋巴细胞的免疫应答反应[8]。

除运载蛋白类抗原外，胶体金也被用作DNA或RNA疫苗的载体，甚至细菌膜[9]的载体。Paul等[10]将抗登革热病毒（DENV）的小干扰RNA（siRNA）与胶体金连接，发现阳离子胶体金-siRNA复合物可以进入Vero细胞，并显著降低感染后DENV血清型2的复制和感染性病毒的释放。此外，经过RNase处理的胶体金-siRNA复合物仍能抑制DENV的复制，表明胶体金对RNA可以起到保护和稳定的作用。

2 胶体金佐剂效应的影响因素

研究发现，胶体金兼具抗原递送载体和佐剂效应[11]，且受到胶体金自身理化性质的影响。

首先，粒径作为胶体金的重要物理参数，对其体内分布及免疫佐剂效果有显著影响。Kang等[12]用卵清蛋白（OVA）包被胶体金，并给OVA额外添加了2个半胱氨酸基团，以通过Au-S键与胶体金发生共价键合。不同粒径胶体金对OVA向淋巴结的输送效率和诱导CD8+T细胞反应的影响结果表明，22和33 nm的胶体金比10 nm的胶体金具有更高的淋巴结转运效率，且能诱导更强的免疫反应。Quach等[13]研究了不同粒径胶体金对登革热抗原免疫应答反应的影响，发现随胶体金的粒径和浓度的增加，特异性抗体滴度也随之明显升高。以上研究表明，在一定范围内，粒径较大的胶体金更有助于免疫应答反应的产生。

Barhate等[14]研究了不同粒径胶体金对破伤风毒素（TT）二级结构的影响，发现20 nm的胶体金可导致TT二级结构发生改变，抗原的免疫活性降低95%，而40和80 nm的胶体金则不会对TT二级结构和免疫活性造成明显影响。然而，口蹄疫病毒（FMDV）疫苗的研究者发现，并非胶体金粒径越大越有利于疫苗产生免疫应答反应，平均粒径为8～17 nm的胶体金产生的免疫反应最强，而且未发现免疫后的小鼠血清中有针对胶体金的抗体产生[15]。由此可见，胶体金的免疫佐剂效果没有绝对的粒径依赖性，其具体粒径的选择还与其所应用的抗原有关。

其次，胶体金的形状对其免疫佐剂有一定影响。Dykman等[7]探究了不同粒径、形状的胶体金对抗原特异性抗体产生的影响，结果显示相对于其他形状的胶体金，金纳米球的免疫佐剂效果最佳，且50 nm的金纳米球产生的特异性抗体比15 nm的更多。其在报道中所列不同形状的纳米金免疫动物所产生的特异性抗体滴度顺序为：纳米球（nanosphere）＞纳米壳（nanoshells）＞纳米星（nanostars）＞纳米棒（nanorods）。

Niikura等[16]进一步系统研究了胶体金形状对西尼罗河病毒（WNV）体内和体外免疫应答反应的影响。球形（直径20和40 nm）、棒状（40 nm×10 nm）及立方形（40 nm×40 nm×40 nm）的胶体金作为免疫佐剂，并用WNV包膜（Es）蛋白包裹。结果表明40 nm的金纳米球产生的抗体水平最高。为了研究形状依赖性WNV抗体产生的机制，他们采用巨噬细胞 Raw264.7对胶体金的细胞摄取效率进行了分析，结果显示金纳米棒比球形更容易被细胞摄取，表明抗体的产生并不直接依赖于胶体金的细胞摄取效率。用胶体金处理骨髓来源树突状细胞（BMDC），再对其表达的细胞因子水平进行检测，结果只有金纳米棒-Es处理的细胞产生显著的白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18），表明金纳米棒可激活炎症依赖性细胞因子的分泌。同时，金纳米球40-Es和立方金-Es均能显著诱导炎症细胞因子的产生。这些结果表明，胶体金是一种有效的疫苗佐剂，随着其大小和形状的不同，将会通过不同的细胞因子途径产生免疫应答反应。

最后，表面修饰/改性对胶体金发挥免疫佐剂效应也存在影响。Moyano等[17]研究发现，在脂多糖（LPS）存在的条件下，表面经疏水性修饰的胶体金能促进在小鼠体内的炎症反应，提示其具有免疫佐剂效应，而PEG修饰的亲水性胶体金则显示出良好的抗炎活性。

表面经多糖修饰后的金纳米粒子更容易被树突状细胞摄取，能有效增强抗原提呈和T细胞应答，有助于抗肿瘤免疫治疗。Climent等[18]在体外细胞实验中证明了表面修饰HIV肽和甘露糖苷的金纳米粒子，能显著增强特异性CD4+和CD8+T细胞的增殖，可促进pro-Th1细胞因子和趋化因子的分泌，适当分泌pro-Th2细胞因子，显著提高促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）与IL-1β的分泌。Safari等[19]以胶体金负载由45%四糖和5% OVA323-339组成的糖蛋白产生特异性抗肺炎链球菌14型包膜多糖（PN14PS）的IgG抗体，细胞因子检测表明多糖修饰的金纳米粒子更能激活辅助性T细胞。

作者团队也曾分别制备了OVA与胶体金的物理共混物（OVA+GNPs）以及两者的共价复合物（OVA@GNPs），其平均粒径均为5 nm左右。通过对比研究，最先发现并提出抗原与胶体金的结合方式，同样会影响其体外稳定性及体内免疫效果。采用一步法制备的共价复合物OVA@GNPs能有效诱导小鼠产生与铝佐剂相当的免疫应答反应，且使用剂量极低，安全性高，制备方法简单可行，可应用于其他抗原[20]。

以上研究结果显示，胶体金能促使细胞因子分泌，帮助多种类型抗原提呈而其本身无明显的细胞和免疫毒性，可单独或联合其他佐剂发挥免疫佐剂效应，有望作为潜在的新型免疫佐剂。然而由于胶体金的粒径和形状存在多样性，且均会影响到免疫细胞的摄取以及细胞因子的释放，产生不同的免疫效应，再加上纳米粒子表面的亲疏水性和糖基化修饰等与其与免疫细胞的相互作用密切相关，胶体金作为免疫佐剂还有待于更加具体、深入和广泛的研究。

3 胶体金在无针免疫中的应用

3.1 胶体金在黏膜免疫中的应用

现已获批上市的疫苗大多通过皮下或肌肉注射完成接种[21]。注射接种倾向于诱导机体产生系统性免疫，较难引发局部的黏膜免疫。如果能诱导分泌针对黏膜表面特定病原体的IgA（sIgA）抗体，就可以有效预防通过黏膜传染的疾病，但目前只有少量的黏膜免疫类疫苗被获批上市，提示该类疫苗的研发存在较大的难度和挑战，其主要原因在于：①黏膜长期接触各种抗原，易发生免疫耐受，因此需要高剂量的抗原刺激或配合使用强免疫佐剂；②由于黏膜环境存在各种酶以及微生物，要成功引发免疫应答反应，抗原需要具有良好的稳定性；③经黏膜免疫的疫苗须穿透防御性良好的上皮细胞屏障，才有可能被黏膜的抗原提呈细胞捕获。因此，与注射类疫苗不同，依靠黏膜递送疫苗由于在实际应用中接种剂量存在不确定性，且黏膜免疫后所产生的sIgA不易被检测[21]，开发能够帮助抗原通过黏膜，并产生相应免疫应答的疫苗载体，对黏膜疫苗的成功研发至关重要。

理想的黏膜免疫抗原载体，需要能够保证抗原的稳定性、生物利用度以及抗原摄取率，且载体应具有佐剂活性或可搭载有效的免疫佐剂。胶体金作为潜在的抗原载体之一，能够有效提高抗原在体内外的稳定性[22]，可通过不同的作用方式与抗原结合，并在胶体金表面高密度展示。胶体金的粒径大小可控，尤其小粒径的胶体金易于穿过上皮细胞与淋巴细胞接触，发挥佐剂效应。目前已有研究报道胶体金在鼻疽病、流感及破伤风等疾病中作为抗原载体，展示其在黏膜免疫中的潜在应用前景。

鼻疽病的病原体是鼻疽假单胞菌，通过气溶胶经呼吸道感染，致死率高。研究发现其LPS的O抗原与其毒力有关，Gregory等[23-24]构建了LPS多糖偶联胶体金疫苗，经鼻接种后，比游离LPS能产生更高的抗体滴度，且在小鼠和非人灵长类动物中均显示出良好的免疫效果，有效减少了鼻疽假单胞菌的感染率，显著提高了免疫后动物的生存率。

流感病毒所含的2种抗原膜蛋白——血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的快速突变，可降低甚至消除流感疫苗的有效性。Wang等[25]利用胶体金开发了一种新的流感疫苗制备方法，以18 nm金纳米球作为载体，HA为抗原，联合鞭毛蛋白（FliC）免疫佐剂，制备H3N2流感病毒疫苗，动物实验发现该疫苗能够产生显著高于两者单用，即HA/FliC和GNPs-HA的抗体滴度。

Tao等[26-27]将甲型流感病毒基质2蛋白（M2e）高度保守的胞外区与胶体金结合（M2e-GNPs），另辅以CpG免疫佐剂，通过鼻内接种检测纳米粒子复合物诱导小鼠产生的抗体滴度以及对小鼠流感的免疫保护作用。结果表明，无CpG时，在初免M2e-GNPs的42 d后能产生较强的免疫应答反应，只在一定程度上减少流感病毒PR8-H1N1感染小鼠后的死亡率，而额外添加CpG佐剂组在初免后21 d即可产生显著的免疫反应，并且在较长时间内（8个月以上）降低流感的发病率和死亡率。该疫苗不仅对H1N1产生免疫应答反应，同时还能对H3N2、H5N1其他病毒亚型产生强烈的免疫应答反应，起到良好的交叉免疫保护效果[28]。

Barhate等[22,29]制备了壳聚糖功能化金纳米粒（CsGNPs），用于破伤风类毒素（TT）和皂树（Quillaja saponaria，QS）或总序天冬（Asparagus racemosus，ARE）萃取物的共同载体。小鼠经口服接种后，TT-QS-CsGNPs诱导的免疫应答显著高于单用对照组（28倍）。TT-ARE-CsGNPs组产生的特异性IgG（34.53倍）和IgA（43.75倍）也得到了显著增加。与普通TT组相比，基于ARE的疫苗组对TT的局部免疫应答也显著增加，且该疫苗的体外稳定性较好。

以上研究表明，胶体金经鼻腔或胃肠道的黏膜免疫，可作为抗原的稳定和保护剂，帮助和促进抗原透过黏膜上皮屏障，从而被免疫细胞捕获，产生免疫应答反应。

3.2 胶体金在经皮免疫中的应用

人体皮肤中所含的朗格汉斯细胞和树突状细胞是重要的抗原提呈细胞，具有捕获外来抗原并在引流淋巴结中呈递抗原的重要作用。此外，表皮和真皮中含有丰富的角质形成细胞和其他免疫细胞（如肥大细胞）可以分泌细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化因子可以调节免疫反应。抗原转运实验证明，通过皮肤接种疫苗比常规肌肉注射更有效地将抗原转移到淋巴结[30]，因此经皮免疫是非常具有吸引力的免疫接种方式，但由于角质层的屏障作用，一直难以实现。

角质层由数层扁平角质细胞组成，胞内是密集的角蛋白，胞间则充满了角质小体释放的脂类物质。正常皮肤一般只允许中度亲脂性（脂水分配系数logP 2～3）和小分子（相对分子质量＜500）透过，水溶性的大分子抗原类物质无法直接透过角质层。为了实现经皮免疫，有各种手段被用来促进抗原透过角质层，包括使用促透剂、超声、激光、电穿孔、微针等方法。其中微针被认为是最具前景的一项新型透皮应用技术，并且已有微针类疫苗进入临床试验阶段[31]。微针技术无痛且可自行接种，适合疫苗的需求[32]，但在规模化制造过程中存在生产效率和重现性较低，以及生产成本相对过高的问题，使得微针类疫苗的市场化推广存在较大的技术性障碍。

近年来，随着纳米材料和技术的不断发展，有研究表明纳米粒子能够通过不同机制透过角质层，从而进入更深层的皮肤组织。正常的皮肤角质层含有直径小于10 nm的孔隙，纳米粒子可与脂质相互作用，增加脂质流动，因此小粒径的刚性纳米粒子有可能穿透角质层。一些有机纳米颗粒，联合应用透皮制剂技术，如脂质体、胶束、纳米乳等，可降低皮肤扩散的屏障。对于粒径较大的纳米粒子，有研究认为还可依靠毛囊等旁路途径进入皮肤。另外，纳米粒子的亲疏水性也与其透皮性密切相关[33]。

目前学界关于胶体金的透皮性尚无统一定论。有日本的研究结果显示，15 nm的胶体金相对于102和198 nm的胶体金，在皮肤深层的数量明显增加，而198 nm的金纳米粒子则主要聚集在表皮区域[34]。之后Huang等[35]的研究也支持了小粒径胶体金有助于透皮的观点。他们发现5 nm胶体金可广泛分布在表皮层和真皮层，在毛囊区域并没有观察到胶体金，认为5 nm胶体金通过与皮肤脂质相互作用，可使角质层出现短暂且可逆的开放，允许胶体金及蛋白分子透过。然而有人针对其操作方法中的“在胶体金处理前先用纱布润湿小鼠皮肤10 min”提出了质疑，认为该处理可能会破坏小鼠皮肤的结构，从而增加胶体金的皮肤透过性[36]。

Raju等[37]研究了不同粒径的胶体金对大鼠足底的透过性，将大鼠后足暴露于不同粒径的胶体金3 h，然后取后足皮肤进行切片染色观察，结果发现粒径为22、105和186 nm的胶体金在3 h后均能透过角质层进入表皮深层。

尽管关于胶体金的透皮依然存在争议，但最近的一些研究显示通过对胶体金进行表面修饰或与近红外联用能有效增加胶体金的透皮性。Hsiao等[38]考察了平均粒径为10 nm的胶体金，以及分别经过PEG（GNS-PEG）和PEG油酰胺（GNSPEG-OAm）修饰的胶体金，在与大鼠皮肤作用24 h后的皮肤透过情况，结果均显示普通胶体金只在角质层聚集，而修饰的胶体金能渗透到深层皮肤组织，尤其GNS-PEG-OAm在大鼠各层皮肤组织均有分布，且还能观察到在皮下脂肪组织聚集。另外研究还发现GNS-PEG-OAm在毛囊区域显著增多，提示其可能通过毛囊途径进入皮肤。随后该课题组又继续考察了PEG-OAm修饰的不同形状和粒径的胶体金的透皮效果，结果显示GNP-PEG-OAm的透皮能力还与胶体金的形状相关，但与粒径大小无关。棒状的胶体金在表皮的富集量是球状的1.9倍，而在皮下脂肪组织的富集量是球状的1.7倍[39]。

作者团队也曾同样研究过胶体金作为蛋白类抗原经皮递送载体的可能性，但结果表明小粒径GNPs作为蛋白透皮载体的能力非常有限，在不破坏角质层的情况下无法实现透皮免疫[20]。

日本有研究者[40]利用金纳米棒的光热效应对大分子的透皮递送及其影响进行了探讨。体外研究发现，金纳米棒在低功率连续近红外（能使皮肤升温）和脉冲近红外（不改变皮肤温度）联合应用下均能促进OVA蛋白的透皮递送。然而体内研究却发现，采用相同强度的脉冲近红外照射皮肤，并不能明显促进OVA的透皮效果，而额外借助一些辅助设备，如圆筒小杯或采用多糖类凝胶，将金纳米棒局限在某一区域内，可增强OVA的透皮效果。

由此可见，胶体金在无针免疫的具体应用过程中，除了考虑自身的理化性质和表面修饰以外，还需要选择和借助合适的剂型和应用手段。

4 胶体金在疫苗应用中存在的问题及展望

虽然胶体金或金复合物已有几项产品获批用于临床治疗某些疾病，如Auranofin、Solganal和Myochrysine，但尚未真正实现在疫苗领域的应用，分析原因可能有几方面。

首先，关于胶体金的免疫佐剂效应缺乏系统深入的研究。虽然有很多针对胶体金的粒径、形状及表面修饰对免疫应答影响的研究，但其潜在机制尚未得到论证。第二，虽然胶体金合成过程简单，但在合成粒径均一、重现性良好的非聚集态纳米颗粒方面仍存在困难。第三，目前缺乏有效的胶体金定量方法，使得产品质量控制存在一定困难。第四，对胶体金的物理特性如何影响其体内分布及代谢的理解还不够深入和全面，导致对胶体金的生物安全性还存在某些争议。因此，结合现代药剂技术，进一步优化不同粒径、形状胶体金的合成工艺，探究胶体金定量方法非常关键。同时，了解不同胶体金的体内动力学过程及其与免疫系统的相互作用，将有助于胶体金的临床转化。

大量研究已证明胶体金能与机体免疫细胞相互作用，促进免疫相关细胞因子的释放，具有较好的疫苗递送能力和免疫佐剂效应。虽然关于胶体金与免疫系统的具体作用机制尚不明确，胶体金的规模化生产、质量检测等技术性问题也尚待解决，但随着对胶体金不断的深入研究，在不久的将来有望能够真正实现胶体金作为疫苗的新一代载体和佐剂，以及在疫苗无针化免疫接种中的应用。