响应面法优化核桃乳发酵工艺

,4,*

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025; 2.贵州省凤冈县农牧局,贵州遵义 564200; 3.贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳 550005; 4.贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州贵阳 550005)

我国植物蛋白资源丰富,廉价且具有较高的营养价值和良好的理化特性,是人体所需蛋白质的主要来源之一[1]。以植物蛋白代替动物蛋白生产乳酸菌发酵饮料具有广阔的市场前景。但从当前核桃目前的加工利用现状来看,国内食品行业针对核桃的加工利用还仅限于初级食品的制作,产品附加值较低,并没有将核桃的资源优势和营养保健优势充分利用与开发。为使核桃资源得够综合利用,为人类带来更大的益处,加强对核桃的深加工,开发具有高技术含量的核桃产品十分必要[2-3]。

乳酸菌是一类能利用糖并产生大量乳酸的细菌,在其发酵食品及产物中不产生任何毒素,乳酸菌发酵最直接的作用是提高发酵食品风味和适口性[4-5],并且可产生对人体有益的成分[6]。另外,活性乳酸菌进入人体消化道内与有害菌竞争营养元素,定值在肠道中具有抑菌作用且可调节改善肠道功能[7]。

关于核桃发酵乳的研究,国外学者对发酵植物蛋白饮料研究主要集中在发酵型酸豆乳、发酵花生乳,发酵核桃乳报道较少;例如Baldwine等对豆乳中加入乳清粉发酵后的产品进行了研究[8]。Sunny-Roberts等用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种发酵花生乳[9]。国内对核桃发酵乳的研究报道较多,一般采用已有的、成熟的菌种进行发酵。

本研究采用的植物乳杆菌是前期实验从贵州酸汤中分离得到的,具有产蛋白酶的能力的乳酸菌,其蛋白酶活力为(2.045±0.012) U/mL。本文以核桃乳作为发酵底物,探究此植物乳杆菌与使用成熟的嗜酸乳杆菌混合发酵,研发一种兼具核桃和乳酸菌发酵食品双重优点的植物蛋白发酵饮料,为核桃深加工提供一种可行性途径,也为拓展乳酸菌应用范围提供一定的理论依掘。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)实验室分离、嗜酸乳杆菌ATCC 4356(Lactobacillusacidophilus) 中科院微生物菌种保藏中心(-20 ℃甘油保存);核桃 黔产五号,毕节市阳光食品有限公司;甲醛 分析纯,西陇科学股份有限公司;MRS培养基 上海博微生物科技有限公司;氨基酸混合标准品 色谱纯,日本Wako株式会社。

L-880日立氨基酸自动分析仪 日本wako株式会社;SW-CJ-1G型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;CS2000高速多功能粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司;D-3L高压均质机 美国PhD科技有限公司;SPX-150Bш生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;PHS-3C+pH计 成都世纪方舟科技有限公司;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵核桃乳的工艺流程 核桃仁→脱种皮→压榨→核桃粕→粉碎→过筛(80目)→研磨→调配→均质→核桃乳→灭菌→自然冷却→接菌→发酵→冷藏后熟

1.2.1.1 核桃乳的制备 脱种皮,先将核桃仁放置在零下18 ℃中冷冻2～3 h后取出,迅速用50～60 ℃的蒸汽喷淋15～20 min。再用50～60 ℃混合碱水[2%复合磷酸盐(Na3PO4·12H2O∶Na2HPO4·12H2O∶Na4P2O7·10H2O=7.5∶1.5∶1)∶0.5% Na2CO3∶1% NaOH溶液=1∶1∶1]浸泡20～30 min,最后采用高压水枪冲洗去皮,水流pH为7左右即可。采用高速粉碎机(36000 r/min)将核桃粕粉碎。核桃粕粉与水料液比按1∶8混匀后经胶体磨循环4～5次,使其更加细腻。压榨得到的核桃粕与0.3%羧甲基纤素钠、0.2%单硬脂酸甘油酯、0.5%蔗糖脂肪酸酯、0.5%黄原胶、15%白砂糖混合进行调配[8],得到的核桃乳经过压力为20 Mpa高压均质两次后使得核桃乳口感更细腻丝滑、组织状态均匀。121 ℃、20 min灭菌冷却备用[10]。

1.2.1.2 菌种的活化 第一代液体培养:首先将冻藏的植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌划线于MRS固体培养基中,待其长出单个菌落,然后挑出单个菌落接种至100 mL/瓶(250 mL锥形瓶)核桃乳(按1.2.1中配制),放置在37 ℃摇床中培养12 h;第二代液体培养:将第一代得到的菌液取出1%,添加至100 mL/瓶核桃乳中进行二代液体培养;第三代液体培养同上述操作。活菌数量趋于稳定达到107数量级[11]即可作为菌液备用。

1.2.1.3 发酵核桃乳的制备 待核桃乳冷却后在超净台中按一定比例接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌,在一定的温度条件下发酵。在4 ℃条件下冷藏12 h后熟,得到成品。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 接种量对发酵核桃乳品质的影响 按照1.2.1的工艺流程制作发酵核桃乳,其中固定植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1[12],发酵时间为10 h,发酵温度为37 ℃,考察接种量3%、4%、5%、6%、7%、8%对发酵乳饮料pH、总酸、感官评定得分的影响。

1.2.2.2 菌种配比对发酵核桃乳品质的影响 按照1.2.1的工艺流程制作发酵核桃乳,其中接种量为6%,发酵时间为10 h,发酵温度为37 ℃[13],考察菌种配比植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1对发酵乳饮料pH、总酸、感官评定得分的影响。

1.2.2.3 发酵时间对发酵核桃乳品质的影响 按照1.2.1的工艺流程制作发酵核桃乳,其中固定接种量为6%[14],植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1,发酵温度为37 ℃,考察发酵时间6、8、10、12、14 h对发酵乳饮料pH、总酸、感官评定得分的影响。

1.2.2.4 发酵温度对发酵核桃乳品质的影响 按照1.2.1的工艺流程制作发酵核桃乳,其中固定接种量为6%,植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1,发酵时间10 h,考察发酵温度35、37、39、41、43 ℃对发酵乳饮料pH、总酸、感官评定得分的影响。

1.2.3 Box-Behnken中心组合试验设计 以单因素实验为参考,采用Box-Behnken中心组合试验设计原理,选取接种量、菌种比例、发酵时间及发酵温度4个因素,模糊数学感官评分为评价指标。分别以A、B、C、D为代表,每一个自变量的低中高实验水平分别以-1、0、1进行编码,采用4因素3水平实验设计,优化发酵核桃乳工艺。响应面设计实验因素及水平见表1。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria

表1 响应面设计因素及水平Table 1 Response surface design factors and levels

1.2.4 优化指标的测定

1.2.4.1 总酸 参照GB/T 12456-2008食品总酸的测定。

1.2.4.2 pH 采用数显pH计测定。

1.2.4.3 感官评价 邀请10名专家(男∶女=1∶1)组成感官评定小组,要求评价员评定前12 h内不得饮酒,不食刺激性食物,评定过程严禁互相探讨,样品盛装一样的容器中,编号随机,每评定一份样品用清水漱口,依次对样品进行评价,100分为满分[15-16],发酵核桃乳感官评定标准见表2。

感官评价模糊数学模型的建立:以色泽、香气、滋味、组织形态为因素集,以优、良、中、差为评语集,根据感官评定结果,建立4个单因素评价矩阵,用模糊数学评价方法对其进行分析[17]。

建立评判集:对发酵得到的核桃粕乳样品进行编号,根据表1对发酵核桃粕乳的品质进行模糊数学综合评判,并建立评判集。因素集U={色泽u1,香气u2,滋味u3,组织形态u4};评语集V={好、较好、一般、较差}[18];

权重的确定:权重集X={0.25,0.25,0.30,0.20},即色泽25分,香气25分,滋味30分,组织形态20分,共100分[19-20]。

模糊关系综合评集:模糊关系综合评判集Y=X×R,其中X为权重集,R为模糊矩阵。加权综合性评分法:取实验的考察指标为因素,则因素集U={U1,U2},其各因素隶书函数,如下:U1i=(Y1i-Y1 min)/(Y1 max-Y1 min)选取评价函数为D1=a1U1i+a2U2i式中a1,a2权重系数[21]。

1.2.5 产品品质指标的测定

1.2.5.1 氨基酸 参考GB 5009.124-2016食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定,依据出峰时间、峰面积对氨基酸进行定性、定量分析。

1.2.5.2 氨基酸态氮含量 参照GB 5009.235-2016食品中氨基酸态氮的测定。

1.2.5.3 蛋白质 参照GB 5009.1-2016食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定。

1.2.5.4 乳酸活菌数的测定 参照GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验。

1.3 数据处理

实验重复3次,结果采用平均值±标准差形式表示,单因素实验采用origin 8.6和Excel进行数据处理。响应面实验采用Design Expert 8.0.6进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 接种量对发酵乳品质的影响 由图1可以看出,随着接种量的增加,pH呈先降低后升高的趋势，总酸及感观评分呈先升高后降低的趋势,当接种量为7%时pH达到最低,总酸含量最高,说明菌的产酸能力增强,且能够适应较酸的环境,感官评分也最高为81分,其组织均匀细腻,色泽和滋味均较好;接种量为6%、8%的发酵乳组织状态以及色泽均较好,感官评分较高。综上所述,选取接种量6%、7%、8%作为响应面试验参数。

图1 接种量对发酵核桃乳总酸含量、 感官评分及pH的影响Fig.1 Effects of inoculation on the total acid contents, sensory scores and pH of fermented walnut milk

2.1.2 菌种配比对发酵核桃乳品质的影响 菌种比例1∶1时，pH最低，总酸最高，感官评分也是最高，总酸高有利于发酵奶的凝固，不易裂开。另外，实验中发现菌种比例1∶1、1∶2和1∶3的发酵乳组织状态、气味和色泽很好，感官评分分别为81、80、75。其余条件下的发酵乳虽然组织结构、气味和色泽均不错,但是有少量乳清析出,感观评分也低于上述三个菌种配比,在响应面试验中菌种配比选取 1∶1、1∶2与1∶3。

图2 菌种配比对发酵核桃乳总酸含量、 感官评分及pH的影响Fig.2 Effect of strain ratio on the total acid contents,sensory scores and pH of fermented walnut milk

2.1.3 发酵时间对发酵核桃乳品质的影响 由图3可以看出,随着发酵时间的增加,发酵核桃乳的总酸含量不断上升。当发酵时间为6 h时凝乳不完全,组织疏松;发酵时间达到12 h时凝乳,并且组织均匀、细腻、表面光滑、无气泡,总酸含量为19.62 g/kg;而发酵时间为10、14 h的发酵乳，凝固较好,香味也较浓郁,此时的总酸含量分别为16.68、19.63 g/kg;而发酵时间低于10 h的发酵核桃乳组织较疏松,凝乳不全,核桃乳香气不足。因此，在响应面试验中发酵时间选取10、12、14 h。

图3 发酵时间对发酵核桃乳总酸含量、 感官评分及pH的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the total acid contents, sensory score and pH of fermented walnut milk

2.1.4 发酵温度对发酵核桃乳品质的影响 由图4可看出,当发酵温度为37 ℃时，此时发酵核桃乳有小部分凝乳不完全，但发酵乳滋气味相对较好。当发酵温度为43 ℃时，有大量乳清析出，固有滋味、气味不浓郁，凝固较差。发酵温度为39 ℃的发酵核桃乳,组织均匀细腻,并且表面光滑,固有滋味非常浓郁,其评分最高为82.5。固选取37、39和41 ℃作为响应面实验参数。

图4 发酵温度对发酵核桃乳总酸含量、 感官评分及pH的影响Fig.4 Effect of temperature on the total acid contents, sensory score and pH of fermented walnut milk

2.2 响应面优化试验

2.2.1 模糊数学感官评定 以试样1的发酵核桃乳样为例,可建立色泽、香气、滋味和组织状态4个单因素的模糊评价矩阵:A色泽=[0.6 0.4 0.0 0.0],A滋味=[0.1 0.4 0.5 0.0],A香气=[0.0 0.4 0.4 0.2],A组织状态=[0.7 0.2 0.1 0.0]。把上述对1号样品的4个单因素评价结果写成一个模糊矩阵:

2.2.1.1 模糊关系综合评判集:

其中,Y11=(0.25^0.6)∨(0.30^0.1)∨(0.25^0.0)∨(0.2^0.7)=0.25,处理后可得Y1=(0.25 0.3 0.25 0.2),同理可得Y2-Y29。

2.2.1.2 模糊综合评判结果 设定感官特殊性:优为100分,良为80分,中为60分,差为40分可建立感官特殊性数集V=(100 80 60 40),则样品的模糊综合评判总分为T=Y×V,得到1号核桃粕乳T1=(0.35 0.30 0.12 0.23)×(100 80 60 40)=75分;同理得编号为T2～T29的发酵核桃乳模糊综合评判结果[22]。

2.2.2 响应面试验结果

2.2.3 回归分析拟合及方差分析 响应面结果见表3，运用Box-beheken响应面分析法对实验结果拟合的模型进行方差分析[23-25],模型中各系数显著性检验结果见表4,该模型的F值为16.65,大于0.01水平上的F值,且P<0.0001,说明该模型极显著,该模型的决定系数R2=94.39%,说明该模型的拟合度良好,能够预测响应值。在统计学上有意义,失拟项F=2.59,P=0.1861>0.05,不显著,说明该模型回归方程不失拟,能充分反映实际情况,可以用回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。复相关系数越大,表明变量之间的线性关系程度越密切。各因素中,一项A、B、C、D,二次项C2、D2,交互项AB、AC、AD、BD、CD对发酵核桃乳感官评分均影响显著(P<0.05或P<0.01)。由F值可知,各因素对发酵核桃乳感官评分影响程度依次为接种量=发酵时间>菌种配比(植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌)>发酵温度。图5～图14为两两因素交互作用对响应值的影响。由图5～图14可知,AB、AC、AD、BD、CD响应面图的曲面坡度较为陡峭,等高线分布较为密集,说明此两因素间的交互作用对响应值具有显著影响。

表3 响应面优化试验设计及试验结果Table 3 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

表4 感官评分回归分析结果Table 4 Regression analysis of sensory score

注:*表示差异显著,即P<0.05,**表示差异极显著,即P<0.01。

图5 Y=f(A,B)响应面图Fig.5 Response surface of Y=f(A,C)

图6 Y=f(A,B)等高线图Fig.6 contour of Y=f(A,B)

图7 Y=f(A,C)响应面图Fig.7 Response surface of Y=f(A,C)

图8 Y=f(A,C)等高线图Fig.8 Contour of Y=f(A,C)

图9 Y=f(A,D)响应面图Fig.9 Response surface of Y=f(A,D)

图10 Y=f(A,D)等高线图Fig.10 Contour of Y=f(A,D)

图11 Y=f(B,D)响应面图Fig.11 Response surface of Y=f(B,D)

图12 Y=f(B,D)等高线图 Fig.12 Contour of Y=f(B,D)

图13 Y=f(C,D)响应面图Fig.13 Response surface of Y=f(C,D)

图14 Y=f(C,D)响应面图Fig.14 Response surface of Y=f(C,D)

2.2.4 验证性试验 根据建立的模型通过软件进行最优分析[26-28],在接种量8%、植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1、发酵时间:12.73 h、发酵温度40.99 ℃时感官评分为82.5分,将上述条件简化为接种量8%、植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1、发酵时间:12.7 h、发酵温度41 ℃,实际得到的感官评分为85分,误差率为2.94%,因此确定上述模型可靠具有参考性。

2.2.5 氨基酸含量测定结果 测定最佳工艺条件下发酵的核桃乳氨基酸含量与未发酵的核桃乳相比,氨基酸标准品分析图谱如下图15,未发酵核桃乳氨基酸含量图谱如下图16,发酵核桃乳氨基酸含量如下图17。

图15 氨基酸标准品图谱Fig.15 Amino acids contents map of fermented walnut milk

图16 未发酵核桃乳氨基酸含量图谱Fig.16 Amino acids contents map of fermented walnut milk

图17 发酵核桃乳氨基酸含量图谱Fig.17 Amino acids contents map of fermented walnut milk

将未发酵的核桃乳与优化发酵工艺后的核桃乳氨基酸含量进行对比,结果如表5所示。

由表5可知发酵核桃乳与未发酵的核桃乳相比,检测出蛋氨酸和酪氨酸,与未发酵核桃乳对比，除了半胱氨酸减少以外,其他氨基酸都有不同程度的增加,夏君霞等[29]研究的益生菌发酵纯核桃乳,其中8种必需氨基酸含量均有不同程度的增加,而本文研究的有15种氨基酸都有不同程度的增加,可能是因为菌种发酵产生蛋白酶使得核桃中的大分子蛋白质分解成小分子的肽或是氨基酸。

表5 各氨基酸含量对比Table 5 Comparison of the contents of amino acids

2.2.6 产品品质指标测定结果 在最佳工艺条件下得到的核桃乳进行理化指标的测定,对于益生菌发酵核桃乳目前暂时未查到相关国家标准,参考GB 7101-2015 《食品安全 国家标准 饮料》和QB/T 4222-2011 《复合蛋白饮料标准》,要求活菌型(未杀菌)产品乳酸菌活菌数≥106cfu/g(mL),本发酵乳活菌数为7.78×108cfu/g(mL),蛋白质含量≥0.7 g/100 g,本发酵乳蛋白质含量为1.05 g/100 g,微生物限量、感官要求符合GB 7101-2015《食品安全 国家标准 饮料》,微生物限量符合GB 4789.26-2013,目前对氨基酸含量未做出要求,本发酵乳氨基酸含量为1.3586%,未发酵的核桃乳氨基酸含量为1.1848%，发酵核桃乳氨基酸较未发酵的提高了0.1738%，氨基酸态氮68.6 mg/100 g，pH为3.88，总酸含量为25.63 g/kg。

3 结论

通过响应面试验,结合实际生产确定发酵乳最佳发酵工艺条件为:接种量8%,植物乳杆菌乳杆菌∶嗜酸乳杆菌菌=1∶1,发酵时间12.7 h,发酵温度41 ℃。感官评分85分,后熟12 h乳酸菌活菌数为7.78×108cfu/mL,pH和总酸分别为3.88与25.63 g/kg,氨基酸态氮68.6 mg/100 g,蛋白质含量1.05 g/100 g,在此生产条件下生产的发酵核桃乳组织状态均匀细腻,酸度适中,气味浓郁,口感及品质均得到提升,本文研究发现发酵核桃乳氨基酸含量为1.3586%，与未发酵的相比，氨基酸总含量提高0.1738%,该实验方法得到的最佳生产工艺参数真实可靠。