常压室温等离子体技术在微生物诱变中的应用进展

徐欢欢, 张红兵, 李会宣, 李磊

河北经贸大学生物科学与工程学院, 石家庄 050061

随着社会的不断发展，微生物已经被广泛应用于食品、医药、环境等许多生产领域，与人们生产和生活的关系日益密切。自然界中微生物的遗传与突变是其生存的重要方式[1]，但自然突变率低，有效性和时效性均不理想[2]。因此，如果微生物的某些性能难以满足需求，就必须通过物理、化学、生物等诱变方法，加速其突变进程，再通过筛选获得有益的突变来满足需求。其中，物理诱变包括紫外线、X射线、微波、辐射及离子束注入等方法[3]，化学诱变最常用的是烷基化试剂、叠氮化试剂等化学试剂[4]。这些方法的基本原理都是通过对DNA造成损伤致使发生基因组水平上的突变，再通过筛选获得目的突变菌株。但由于突变的随机性，导致效率低、可控性差[5]。近年来，一些物理新兴技术迅速发展，其中，常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)技术以操作简单、条件温和、安全便捷、突变效率高的优势在生物技术领域倍受青睐[6]。基于此，本文对ARTP诱变技术的原理及其在微生物诱变育种方面的应用展开综述，以期为该技术相关应用研究提供借鉴和帮助。

1 常压室温等离子诱变原理

等离子体是由大量相互作用的非束缚状态下的带电粒子组成的宏观体系，是物质形态的第四态[7]。常压室温等离子体是常压非平衡放电等离子体(atmospheric non-equilibrium discharge，APNED)的一种，由带电粒子、自由基、中性粒子、光子及电磁场组成。ARTP诱变育种仪采用氦气作为工作气体，使氦气在大气压下能够产生高浓度活性粒子(激发态氦原子、氢原子和氧原子)的等离子体射流[8]。高浓度的活性粒子能够使DNA单链或双链发生断裂，造成DNA损伤，进而诱发细胞启动应急修复机制，引起微生物突变[9]。ARTP技术产生的突变也可以发生在微生物细胞表面，使胞内遗传物质产生变化进而间接改变细胞的代谢途径[10-11]。

2 ARTP诱变技术的应用

ARTP诱变技术极大程度地加快了微生物诱变育种的进程，在菌种改良，特别是提高微生物合成能力等方面应用广泛。

2.1 在生物酶制备方面的应用

生物酶是一种微生物发酵后经分离提取得到的耐高温、无毒、无腐蚀性的高效且环保的生物制剂[12]，常应用于食品、医药、纺织印染等行业。在提高微生物产酶能力方面，ARTP技术取得了很大的成功。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)作为一种新型的氧化还原酶辅酶，在医药和食品等领域有广阔的应用前景。利用ARTP对高产PQQ菌株扭脱甲基杆菌AM1进行诱变，突变株PQQ产量达到54.0 mg·L-1，是出发菌株的近3倍[13]。同时，ARTP技术的应用也有助于提高生物酶的活性及其他酶学性质。Wang等[11]以节肢杆菌KQ11为出发株进行ARTP诱变，得到了2株突变体，其右旋糖酐酶的酶活分别提高了19%和23%。谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶)能催化蛋白质分子内、分子间的交联，具有改善蛋白质的营养价值、质地结构、口感等功能。利用ARTP诱变技术处理茂源链霉菌，诱变株的谷氨酰胺转氨酶酶活相比出发株提高了82%[14]。脂肪酶是一种重要的工业用酶，主要用于改进食品风味、水解油脂、皮革绢纺脱脂等。王兴吉等[15]对产脂肪酶黑曲霉菌株AG007进行ARTP诱变，成功选育出产脂肪酶活力较原始株提高了86%的突变株，并通过酶学特性研究发现，其在0 ℃左右能够保留30%的活性，表明该菌株是一种低温脂肪酶。单宁酶是一种能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键的水解酶[16]，常被应用在化工、酿造、皮革、饲料、制药、食品等行业。利用ARTP诱变技术处理黑曲霉B0201，诱变株产单宁酶酶活为17.61 U·g-1，是原始菌株酶活8.94 U·g-1的2倍左右，且传代菌种产单宁酶稳定性良好[17]。

2.2 在氨基酸制备方面的应用

ARTP诱变技术在提高微生物合成氨基酸能力方面也发挥着显著作用。ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一种天然的赖氨酸同聚物，具有抑菌范围广、水溶性强、热稳定性好、安全性高、可降解等优点，是食品防腐剂的理想选择。赖永勤[18]以菌株SAB为出发菌株，进行ARTP诱变，突变株ε-PL产量可达2.096 g·L-1，与原始菌株SAB(0.959 g·L-1)相比，提高了118.6%。L-异亮氨酸(L-isoleucine，L-Ile)是人体8种必需氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、化妆品与医药行业。利用ARTP技术对黄短杆菌I-12进行诱变，诱变后的菌株产酸量比出发菌株提高了44.75%[19]。L-谷氨酸(L-glutamate，L-Glu)是人体的非必需氨基酸，参与细胞内多种氨基酸的合成过程，是目前世界上产量最大的氨基酸，在食品、医药行业、人造制革、化妆品工业及农业生产上都有广泛的用途。梁玲等[20]以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌GY1为研究对象，进行ARTP诱变，获得的突变株摇瓶发酵L-谷氨酸含量较原始菌株提高了13.9%，且遗传稳定。

2.3 在药物制备方面的应用

通过ARTP技术对药物生产菌株进行诱变，可有效提高菌种效价及产物转化率等，大大优化菌种性能，提高经济效益。螺旋霉素具有十分良好的体内抗菌作用，且副作用较红霉素小，可用于治疗由革兰阳性菌和某些革兰阴性菌引发的呼吸道疾病。周德龙等[21]以ARTP技术对螺旋霉素生产菌株进行诱变，得到的突变株效价较原始株提高了21.7%，且性状相对稳定。环孢菌素A(ciclosporin A，CyA)在代谢中可产生失去了免疫抑制活性的环孢菌素衍生物[γ-HyMeLeu4]CyA，其抗菌谱窄，但仍具有抗真菌特性。采用ARTP技术对稀有放线菌株进行诱变，获得了具有稳定遗传性能且[γ-HyMeLeu4]CyA的转化效率比出发菌株提高32%左右的诱变株[22]。氢化可的松(hydrocortisone，HC)又称皮质醇、可的索，为肾上腺皮质激素类药物，是甾体激素类药物中产量最大的品种之一，同时也是很多甾体激素类药物的中间体。利用ARTP-LiCl复合诱变方法对一株蓝色犁头霉进行诱变，突变株的HC转化率达72.52%，底物投料浓度和HC转化率与原始菌株相比均有提高，且该菌株遗传稳定性较好[23]。雷帕霉素(rapamycin，RPM)是一种具有免疫抑制活性的大环内酯类化合物，是一种低毒性的抗真菌药物和抗肿瘤药物，后续研究中发现RPM也可用于治疗阿尔茨海默症。王欣荣等[24]采用亚硝基胍(nitrosoguanidine，NTG)、ARTP、核糖体工程育种复合方法处理产雷帕霉素游动放线菌SIIA-1602，获得的诱变株发酵水平较原始菌株提高了55.7%；同时，发酵过程中该突变株总氮源使用量减少了一半，放罐过程中氨基氮排放量和菌渣量也明显降低，在环保方面也取得了显著的成效。

2.4 在有机酸制备方面的应用

对产有机酸菌株加以ARTP诱变，可明显提高其产酸速率、产酸量及菌株稳定性，ARTP诱变技术对有机酸的生产也具有重要意义。乳酸是三大有机酸之一，因其安全性高、光学活性小，常被应用在食品、制药、皮革等领域。王光耀[25]通过ARTP技术处理拟干酪乳杆菌，结合高通量筛选方法，成功选育出一株产乳酸速率快，且糖转化率和单位菌体产乳酸量较高的突变株。柠檬酸是一种十分重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等行业。利用ARTP对柠檬酸生产菌黑曲霉进行诱变，与出发菌株(产酸12.46 g·dL-1)相比，诱变株产酸增幅达到8.67%[26]。丙酮酸是近年来需求量不断增加的一种重要有机酸，在化工、制药、农用化学品等领域被广泛使用。司晓光等[27]通过ARTP诱变技术处理光滑球拟酵母，成功选育出一株诱变株，其丙酮酸产量较原始株提高了13.69%，且该诱变株可稳定遗传。

2.5 ARTP技术在微藻领域的应用

同样，ARTP也适用于微藻的诱变育种。由于微藻中的脂肪酸可转化成为被视为化石能源替代品的新型清洁燃料——生物柴油，且其具有分布广、易获取、可再生、繁殖速度快、生产效率高、脂肪含量高、不竞争农业耕地等[28-29]优势，深受学者们的青睐，但成本较高等问题一直是微藻油脂工业化生产道路上的限制因素[30]。目前，降低成本的方法有优化培养基、提高微藻油脂产量、简化油脂制备工艺等。而要提高油脂产量，选育优质高产的藻种是最关键也是最有效的途径之一。吴娟[31]为获得高产油异养小球藻诱变株，采用ARTP技术对小球藻进行了诱变，获得的突变株油脂含量较出发藻株含量高约5.4%。

除了油脂含量发生变化，通过ARTP诱变后微藻中其他成分元素含量也会发生变化。吴晓英等[32]通过ARTP诱变筛选获得高产虾青素的雨生红球藻突变株，该突变株的生物量和生长速率较出发株均有明显提高，突变株的虾青素含量达3.1%，较出发株提髙了51.96%；虾青素产量为71.92 mg·L-1，相比于出发株提高了61.73%；且遗传稳定性实验表明，诱变株生产性能稳定。

本课题组目前正在进行微藻的相关研究，在采用ARTP诱变技术对本课题组筛选分离得到的小球藻进行突变的研究中发现突变株较亲本藻株油脂含量稍高(数据未发表)。

2.6 在其他领域的应用

2.6.1在食品方面的应用 在食品方面，利用ARTP诱变技术对微生物进行诱变后，其生物活性、生长速度、发酵效率等特性均有大幅提升。猴头菌是重要的食药用真菌[33]，具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤、降血糖等功效[34]。采用ARTP诱变技术3株高产多糖猴头菌，结果表明诱变株的多糖活性优于出发株[35]。柱状田头菇(茶树菇)富含大量蛋白质、氨基酸、B族维生素及丰富的矿质元素。王谦等[36]通过ARTP诱变技术对柱状田头菇进行诱变处理，得到的突变株的长速、长势、生物学效率均高于出发株，是能够高效利用荔枝屑生产的新菌株。醋酸菌(acetic acid bacteria)是一类能通过呼吸作用将乙醇氧化成醋酸的需氧微生物，是食醋固态发酵生产过程中的重要产酸菌。采用ARTP对醋酸菌进行诱变，筛选得到的诱变株发酵周期缩短约7 h，发酵效率提高约10%[37]。同时，利用ARTP技术对酿酒酵母进行诱变，在提高其产酒精产酸、降低啤酒中嘌呤及白酒中高级醇方面也有明显效果[38-40]。细菌素是一类由某些细菌分泌的具有抗菌活性的蛋白质类物质，其分类中的Ⅰ类和Ⅱ类(Class Ⅰ、Class Ⅱ)常作为生物防腐剂，被广泛应用在食品工业领域。安宇等[41]采用四轮微波-NTG-ARTP-UV复合诱变方法，对具有降胆固醇能力的植物乳杆菌进行诱变，获得了1株保留降胆固醇能力的高产细菌素突变株，且该突变株产细菌素的抑菌谱较宽，对除枯草芽孢杆菌以外的革兰氏阳性细菌均有抑制作用。

2.6.2在能源方面的应用 ARTP诱变技术在能源生产领域也有一些成功应用的案例。采用ARTP诱变技术对乙酰丁酸梭菌Clostridiumacetobutylicum进行诱变处理，获得的突变菌株发酵葡萄糖可产生11.3 g·L-1丁醇，较出发菌株提高了31%，同时突变菌株能以木薯粉作为唯一底物，在优化发酵条件后，最终可产生12.9 g·L-1丁醇和20.7 g·L-1总溶剂[42]。产电菌也称作胞外呼吸细菌，是一类能够将细胞代谢过程中产生的电子传递到胞外的微生物，广泛存在于自然界中，它们通过厌氧呼吸将电子供体有机物氧化并产生电子，是新型产电能装置微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC)中的重要组成部分。何慧[43]以模式产电菌株为出发菌株进行ARTP诱变，通过电化学探针和高通量方法筛选出的突变株1和突变株5在第1个产电周期内达到的最大电流密度，比出发菌株分别提高约38%和12%，结果说明ARTP能够提高菌株的产电能力，可快速突变此菌株基因组。因鼠李糖脂具备乳化、增溶及降低界面张力等功能，在能源、石油化工、医药及食品等领域均有较大应用前景。采用ARTP对铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaC3进行诱变，最终选育出的突变株的鼠李糖脂产量比原始株菌株提高了74.1%[44]。

2.6.3在农业与环境方面的应用 阿维菌素(avermectin，AVM)是由阿维链霉菌(Steptomycesavermitilis)产生的大环内酯类抗生素，是一种高效的生物杀虫剂，具有残留低、安全、无毒等优点，已被广泛应用在农林业与养殖行业。田萍萍等[45]对阿维链霉菌9-39菌株进行ARTP诱变筛选及发酵培养基优化研究，结果表明ARTP诱变技术能显著提高阿维菌素的产量。

3 展望

ARTP诱变技术以高效、安全、操作简单、环境易得等诸多优点深受学者们的青睐，对选育性能优越的微生物具有良好的应用效果。目前已在食品、医药相关领域得到广泛应用，效果十分明显。但在环境修复、能源、微藻利用等领域应用较少，随着ARTP技术的逐步完善和作用机理研究的不断深入，在这些领域的应用前景也将会更为广阔，该技术的利用效益也会最大化。此外，ARTP技术除了可结合基因组学，在分子水平上对微生物进行联合应用研究，也可以在新型环保材料的研发生产、医学细胞定向诱导的研究以及细胞融合等方面综合利用，并不断拓宽其应用领域，使ARTP技术成为推动社会进步、人类发展的重要技术工具。