抗狂犬病毒中和抗体研究进展

卞论, 林冠峰, 吴英松

南方医科大学检验与生物技术学院, 广州 510515

狂犬病是由狂犬病毒属(Lyssavirus)的嗜神经病毒引起的能感染人类和其他哺乳类动物的传染性疾病，发病后死亡率几乎百分之百。每年均有60 000人死于狂犬病，而且这个数字还在持续增长[1-2]，但是在感染病毒与发病之间进行有效的暴露后预防可以将死亡率降低至几乎零。因此有效的狂犬病暴露后预防方法在提高狂犬病患者生存几率方面极为重要。狂犬病暴露后预防方式与暴露程度有关，狂犬病的暴露程度可分为三种：Ⅰ类暴露为接触猫狗等动物时皮肤被舔，但依然保持完整，如能确认接触的动物并未感染狂犬病毒，则不需要进行处理；Ⅱ类暴露为皮肤被咬伤或轻微抓伤，但是并未出血，这种情况只需要主动免疫，即进行狂犬病疫苗注射；Ⅲ类暴露为皮肤被咬伤或抓伤或者粘膜与已破损的皮肤被动物体液污染，这种情况则需要以暴露后预防(post-exposure prophylaxis，PEP)方式进行处理[3]，主要有三个步骤：①使用清水冲洗伤口，尽量避免伤口残留狂犬病毒；②采取主动免疫措施，即注射狂犬病毒灭活疫苗；③使用抗狂犬病毒中和抗体浸润注射，以达到在主动免疫产生足量抗体之前，快速及时地中和患处及体内狂犬病毒的目的，避免狂犬病毒入侵中枢神经系统。在国内就曾发生过Ⅲ类暴露后仅接种狂犬病疫苗并未注射抗狂犬病毒中和抗体而死亡的案例[4-5]，这也证明了及时注射中和抗体在狂犬病防治中的重要性。中和抗体是B淋巴细胞产生的抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止其侵入细胞。由于中和抗体有着成本高、产量小等局限，难以在基层地区生产和普及。历代科学家致力于改进抗体技术并应用于中和抗体研制，提高中和抗体生产效率。中和抗体经由多抗血清、单克隆抗体及基因工程抗体等技术的发展历程，其研制趋于成熟，本文就抗狂犬病毒中和抗体的发展历程、不同类型中和抗体的优缺点以及中和抗体的未来研究期望作了综述，以期为新一代狂犬疫苗的研发提供参考。

1 狂犬病疫苗简史

作为人类历史中出现的最早的疾病之一，对于狂犬病的相关记载可以追朔至古埃及[6]。17世纪的英文文献中以这种传染病的症状(该病的患者会过度口渴和害怕水)为其命名恐水症(hydrophobia)[7-10]。

1885年路易斯·巴斯德通过将狂犬病动物的脊髓进行干燥处理制备出世界上第一支用于预防狂犬病的疫苗[11]，开启了暴露后狂犬病预防的新时代。在之后的五十年里，研究者们采用了不同的措施对巴斯德最初通过简单而粗糙的干燥方式制备出的狂犬病疫苗进行了改进，以提高安全性和治疗效果。

疫苗的制造工艺发展至今，目前已处于细胞培养疫苗的时代。其中以人二倍体细胞培养狂犬病疫苗作为基准，这是一种使用人类二倍体细胞接种固定病毒后进行培养繁殖，再经过浓缩、灭活等步骤制成的疫苗[7]。这类疫苗治疗效果好，注射后较少产生副反应，是理想的疫苗[8]。

作为第一种纯化浓缩无佐剂的冻干狂犬病疫苗，人二倍体细胞狂犬疫苗(human diploid cell rabies vaccine，HDCV)从1974年上市以来，因其较高的安全性、较好的免疫原性、极少产生副作用等优点，被评价为最理想的狂犬病疫苗。但由于HDCV细胞培养技术难度大、成本高，主要应用在发达国家。目前国内狂犬病疫苗市场占比前三的辽宁成大公司、宁波荣安公司和广州诺诚公司的产品也主要是以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)狂犬病疫苗为主。而以HDCV作为主要产品的成都康华公司[9]、辽宁迈丰公司[10]市场占比还不足3%，这也说明HDCV其在发展中国家普及率较低的窘境。

2 狂犬病毒中和抗体的功能

狂犬病毒中和抗体的作用方式主要分为三种：①中和抗体能够在补体的参与作用下使病毒感染的细胞溶解破碎。当狂犬病毒在宿主体内的细胞中进行复制增殖时，细胞膜会表达病毒蛋白抗原，而这种抗原会被中和抗体识别并产生相互作用，在补体的协助下发生溶解破碎；②中和抗体会结合体内的游离病毒，这会阻断病毒进入细胞的过程，二者组成的免疫复合物也会被吞噬细胞识别并吞噬和清除；③抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，即表达有IgG抗体的Fc受体的NK细胞和巨噬细胞等，通过和已结合于病毒感染细胞表面的IgG抗体Fc段结合，以此来杀伤病毒感染的靶细胞[12]。

3 狂犬病毒中和抗体发展历程

中和抗体的发展历程大概分为三个阶段：第一代抗体的发展始于20世纪初期，早在1895年，Hericourt和Richet[13]就通过将癌细胞注入动物体内，取其产生的抗血清，用于治疗癌症病人，即使用抗原免疫动物获取的能中和对应抗原的多抗血清；第二代抗体，即单克隆抗体，是1975年由Köhler与Milstein利用杂交瘤技术制备[14]，与第一代抗体相比，单克隆抗体由于均由同一B细胞分裂得到的子细胞产生而拥有高纯度、仅针对抗原单一表位、生产量较大等优点。但是由于单抗大部分来自于鼠的杂交瘤细胞，注射后会被免疫系统识别产生人抗鼠抗体从而被中和掉，导致效果锐减[15]，同时还会引起人体产生过敏反应；第三代抗体，也就是基因工程抗体，其发展始于20世纪80年代中期。基因工程抗体是使用分子生物学技术对鼠源抗体进行改造，从而降低人体对其产生的免疫反应，例如使用DNA重组技术对单克隆抗体的鼠源部分进行替换从而构建人鼠嵌合抗体，以实现鼠源单抗的人源化[16]，甚至通过噬菌体展示技术[17]与转基因鼠技术[18]对抗体进行了彻底人源化处理。

3.1 抗狂犬病毒多克隆抗体(抗血清)

抗狂犬病毒多克隆抗体为第一代抗体，即通过使用抗原免疫动物获取的能中和对应抗原的多抗血清。目前常用于PEP的抗狂犬免疫球蛋白主要为抗狂犬病马血清(equine anti-rabies immunoglobulin，ERIG)和抗狂犬病人血清(human anti-rabies immunoglobulin，HRIG)[19]。虽然这两种免疫球蛋白都很有效，但是各自都有缺点。首先ERIG有着非常严重的副反应，譬如严重的过敏反应等[20]，而且还会抑制某些疫苗诱导产生的抗体。尽管有着很多缺点，ERIG在很多发展中国家仍是供不应求[21]。相比之下，HRIG则无副反应，但是由于HRIG需从免疫过的人血清中提取，而且需要供体的抗体滴度达到一定水平，因此产量有限且价格昂贵。同时由于其供体不稳定，导致其存在着血液制品有潜在致病性、批次间有质量差异等问题。

3.2 鼠源抗狂犬病毒单克隆抗体

为了寻找一种可以克服ERIG和HRIG缺陷的新产品，科学家们开始着眼于研制抗狂犬病毒单克隆抗体。从杂交瘤单克隆抗体技术[13]出现以来，单克隆抗体技术发展迅猛，利用单克隆抗体技术生产的抗体拥有高特异性，能够解决多抗血清的部分缺陷，此外还拥有着高安全性、低成本、可量产等优点[22]。在临床诊断、预防以及治疗等方面的应用也日益广泛，其中对治疗性单克隆抗体的研究尤为深入。但由于传统的单克隆抗体为鼠源性，易引发人体抗鼠抗体产生，甚至引发超敏反应。因此直到基因工程抗体出现后，单克隆抗体作为药物才显示出了巨大的应用前景。

1989年Schumacher等[14]利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了多株针对狂犬病毒糖蛋白(glycoprotein，G蛋白)与核蛋白(nuclear protein，N蛋白)的鼠源单克隆抗体，将这些抗体混合使用即为单克隆抗体鸡尾酒疗法(cocktail of anti-rabies monoclonal antibodies，McAb-C)，对小鼠和地鼠进行的保护性试验证明这种方法不仅能够在被动免疫之后抵抗致死量狂犬病毒的攻击，还拥有暴露后保护作用。1990年Dietzschold等[23]研究证明糖蛋白是抗狂犬病毒主要的中和抗原蛋白，为之后以糖蛋白为目的蛋白制备新疫苗及抗体的研究提供了指导方向，也为现代的狂犬病预防奠定了基础。1991年Fu等[24]将狂犬病毒ERA毒株编码N蛋白基因克隆至杆状病毒中，随后在昆虫细胞中大量表达，经过亲和色谱法纯化之后制备出了32株单克隆抗体，其中31株能够正确识别狂犬病毒株。直到2007年，Muhamuda等[25]制备了数株针对狂犬病毒G蛋白的鼠源单克隆抗体，并使用动物模型验证了其对于狂犬病暴露后预防的效果。快速荧光灶抑制试验的结果显示抗体的中和效价达到1 650～75 000 IU·mL-1，能够保护70%～100%接种了狂犬病毒的小鼠或豚鼠。这些单克隆抗体在有效蛋白浓度及中和效价方面高于商业ERIG约2 000倍。

3.3 人-鼠异源骨髓瘤杂交技术

1991年Enssle等[26]通过EB病毒使人源B淋巴细胞实现永生化，再与小鼠骨髓瘤杂交细胞融合制备出人源化抗狂犬病毒特异性单克隆抗体TW-1，并在之后的快速荧光灶免疫试验和体内实验中均能中和病毒及保护小鼠免受感染。2000年Champion等[27]将接受过商品化疫苗接种的人B淋巴细胞通过人-鼠异源骨髓瘤杂交技术进行细胞融合并制备了数株人源化抗狂犬病毒单克隆抗体。虽然这种异源杂交瘤细胞能获得比较稳定的细胞克隆，但是会产生丢失抗体的情况，这个现象可能与染色体丢失有关[28]。

3.4 抗狂犬病毒基因工程抗体

由于鼠源性的单克隆抗体对于人体来说属于异源蛋白，容易刺激免疫系统产生抗鼠抗体并对其进行清除，还极易产生超敏反应[29]，因此很难在临床上进行应用。而人源化单克隆抗体则拥有着副反应小、不易产生超敏反应等优点，更有机会应用于临床治疗。基因工程抗体分为如下几种：人鼠嵌合抗体、互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植抗体、完全人源性抗体、单链抗体、噬菌体抗体(表1)。

表1 几种基因工程抗体的优缺点Table1 Advantage and disadvantage of genetically engineered antibody

3.4.1人鼠嵌合抗体 1984年Morrison等[30]通过获取能够分泌与已知抗原结合的特异性抗体的骨髓瘤杂交细胞系，提取其编码抗体可变区域的基因，并使用重组DNA技术将其连接至人类免疫球蛋白恒定区域基因，创造出了有抗原结合特异性的人鼠嵌合抗体分子，这也是人类历史上第一次研究出人源化的单克隆抗体。人鼠嵌合抗体有着很多优点：①能够自由地选择抗体的亚型、大小、结构域等；②其不但保留了亲本鼠源单克隆抗体的高特异性及亲和力，而且减少了其中70%的鼠源成分；③其中的人源Fc段能够有效地介导各种生物学效应，例如抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等。

3.4.2CDR移植抗体 虽然嵌合抗体的恒定区已经改造为人源化，但是由于其可变区仍是鼠源的，因此仍会引起机体不同程度地产生人抗鼠抗体[31]。而CDR移植抗体则是将人抗体的互补决定区置换为鼠源性单克隆抗体的互补决定区，这种方法制作的抗体仅有极少部分仍为鼠源性。但是这种抗体与抗原的亲和力会下降，大概仅有原抗体的30%～50%。

3.4.3完全人源性抗体 完全人源性抗体是使用基因敲除技术敲除掉小鼠的免疫球蛋白基因，并以人免疫球蛋白基因进行取代，然后再采用抗原免疫小鼠，经过杂交瘤技术生产得到。2007年Sloan等[32]利用携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，得到了数株具有中和活性的人源性单克隆抗体，其中的人源性抗体17C7能够识别狂犬病毒G蛋白的构象表位，并通过建立暴露后预防小鼠模型证实该抗体能够保护仓鼠免受致死量狂犬病毒的感染。

3.4.4单链抗体 Fv片段(variable fragment)是结合抗原的最小功能片段，是由重链可变区与轻链可变区通过疏水作用结合而成，而由于其重链可变区与轻链可变区是由非共价键连接，因此其在体内很不稳定。而随着分子生物学的发展，人们利用DNA重组技术对Fv片段进行了改进，其中研究最多的就是单链抗体。

1988年Huston与Bird等[33-34]最早制备了单链抗体(scFv, single chain variable fragment antibody)，单链抗体是使用一条短肽将重链可变区与轻链可变区连接而成，这种肽链结构不但能够在大肠杆菌表达中更有利于基因重组操作，同时也相应地解决了Fv不够稳定的缺点。单链抗体的优点主要在于其由重链可变区与轻链可变区组成，因此保留了完整的抗原结合部位。而且由于其分子量小，仅有标准抗体的1/6左右，因此拥有较强的穿透力，能更迅速地到达靶向部位。但是相比较于天然抗体的双价结构，单链抗体是单价的，因此其亲合力有所下降。

3.4.5噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是把外源蛋白或者多肽的DNA序列插入至噬菌体外壳蛋白结构基因的合适位置，从而使外源基因随着外壳蛋白一同表达，同时通过噬菌体的重新组装而展示到其表面的技术。大量获取的人源基因工程抗体也因为噬菌体展示技术的出现成为可能[35]。1997年Muller等[36]通过噬菌体展示技术从分泌糖蛋白单克隆抗体的30AA5杂交瘤细胞中分离出了能够中和狂犬病毒的单链抗体片段。2005年Kramer等[37]从接种疫苗的献血者血液中提取抗体基因，成功构建了人源抗狂犬病毒噬菌体抗体库，最终得到了21株全长人免疫球蛋白。

3.5 鸡尾酒单克隆抗体疗法

事实上，由于狂犬病毒拥有较多基因型[38]，且G蛋白序列并不保守，因此针对单一抗原表位的中和抗体并不能达到广谱疗效。因此怎样将针对不同抗原表位的中和抗体联合使用也就成为了治疗性抗狂犬病毒抗体研究的重心。早在1989年Schumacher等[39]就将针对N蛋白与G蛋白的单克隆抗体进行联用并称之为单克隆抗体鸡尾酒疗法。2005年Goudsmit等[40]把针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ号位点的CR57中和抗体和Ⅲ号位点的CR4098中和抗体混合使用，中和了26种经典毒株，证明了鸡尾酒疗法的可行性。2009年Müller等[41]开发了一种由5种鼠源性单克隆抗体联用的鸡尾酒疗法，有望取代HRIG在发展中国家得到广泛使用。2018年Xi等[42]使用CR57和CR4098制备了一系列的单链Fv片段和亮氨酸拉链Fv片段，并使用小鼠和仓鼠模型证明了亮氨酸拉链Fv鸡尾酒疗法比单链Fv鸡尾酒拥有更好的保护效果。

4 展望

虽然已经有很多关于抗狂犬病毒治疗性抗体的专利，但是至今仍没有一种治疗性抗体投放市场。目前用于暴露后预防注射的抗体仍主要为ERIG和HRIG，亟需一种能够量产并且拥有较好的稳定性、安全性和经济性的治疗性抗体投入市场。此外，已经有研究表明，血脑屏障在防治狂犬病毒方面发挥着重要作用[43]，而狂犬病毒则可以通过维持血脑屏障的完整性来逃逸免疫[44]。因此能否利用一些细胞因子帮助治疗性抗体穿越血脑屏障或者通过改造治疗性抗体本身使其能穿过血脑屏障，这些都是值得研究的，这也为科学家们对抗狂犬病毒抗体的研究提供了新的方向。

2019年Marosi等[45]使用免疫调节抑制剂和HRIG同时应用于狂犬病小鼠模型，最后证实无论是暴露前还是暴露后处理组，免疫抑制剂与HRIG联用处理都展现出了更高的保护效果。实验还证实了促炎症细胞因子与分子通路抑制剂可以提高小鼠模型的生存率，并且配合HRIG效果更好。这些研究结果说明抗狂犬病毒抗体在一些物质的协同作用下可以发挥更好的预防作用，也为狂犬病抗体研究提供了新的方向。

目前已上市的抗体药物主要为针对肿瘤或自身免疫疾病方面，用于抗病毒的抗体药物仅有三种，其中用于狂犬病治疗的单抗药物仅有一种——Rabishield。而由于狂犬病毒G蛋白的不保守性，单独一种抗体的使用并不能有效地进行狂犬病防治。因此，针对不同抗原表位的狂犬病抗体的研究也是未来狂犬病抗体研究的主要方向之一。

总的来说，狂犬病的防治不仅要做好暴露前预防，同时要在提高暴露后预防有效性、延长暴露后患者存活时间等方面加强研究。科学家们也需要在这些方面更加努力，使狂犬病的防治措施更加成熟、有效、经济。