分子诊断技术在病原微生物检测中的应用进展

尤明亮

天津市西青区疾病预防控制中心 300393

无论是引起感染甚至传染病的微生物，还是食源性病原微生物，都会给人类健康造成不同程度的威胁，且两种病原微生物之间存在一定的共性，突出表现为种类繁多，变异速度异常迅猛，现有的病原微生物主要包括细菌、病毒等几种类型。针对病原微生物进行科学合理的检测与判断，可起到预防并控制疾病的作用，也给后续用药奠定了基础。传统的微生物检测和判断以病原微生物分离为主，还存在过度依赖病原微生物生理生化特征和形态学观察等问题。这种方法虽然起到了一定的作用，但是存在明显的局限性。加之不断发现的病原微生物的影响，病原微生物检测工作的难度与日俱增，如何更好地完成病原微生物检测，已经成为各级研究人员重点研究的问题。

1 以杂交为核心发展起来的分子诊断技术

1.1 基因芯片技术的应用进展 基于核酸分子杂交发展而来的基因芯片也可称之为DNA芯片，基因芯片技术主要是借助特殊的功法，将核酸探针分子排列至处理过的玻璃片或者硝酸纤维素膜表面，最为常用的方法为光导原位合成，还可适当使用微量点样法。值得注意的是，用于承载核酸探针分子的支持物统一为2cm2。排列工作完成后需要进行杂交，杂交对象以标记样品分子为主，从而利用先进的计算机软件和信息技术判断样品信号，将信号的强弱作为着手点，明确样品中是否存在病原微生物，如果发现病原微生物的存在，还要了解其数量信息[1]。相对于以往的检测技术而言，基因芯片技术的特异性更强，且拥有高通量化的优势。但是受到成本的影响，基因芯片技术还未大面积的推广与使用。另外，基因芯片技术的专业性较强，涉及多个学科，推广难度较高[2]。在医学技术和检测水平不断提高的同时，人们发现了越来越多的特异性记忆，这给基因芯片技术的发展注入了全新的活力。长此以往，基因芯片技术一定会在基层大面积推广并使用，检测结果更是会得到跨越式的提升。

1.2 DNA传感器技术的应用进展 DNA是DNA传感器技术的重要组成部分，扮演着极为重要的角色，起着敏感元件的作用，而核酸杂交则是DNA传感器技术发展的基础与核心。利用DNA传感器技术进行病原微生物检测时，需要在传感器上固定一条单链DNA，此时的DNA序列为已知状态，然后通过与互补单链DNA杂交的方式对病原微生物中的信号进行检测[3]。检测工作主要是围绕可检测信号进行，而现阶段的可检测信号分为光或电几种。因此应利用相应的技术或信号转化器，将原本不可检测的浓度转变为可检测信号[4]。如今，DNA传感器主要由两大部件组成。分别是识别元件还有信号转换器，而敏感元件还可细分至两个类别，分别为免疫传感器，还有DNA传感器。DNA传感器并不是像我们想象中的那样强大，虽然说其速度较快，准确性较高，但是灵敏度却远不及其他类型的传感器，且存在特异性较差的问题。有学者将三种技术联合起来创造了创新型的DNA传感器检测系统，这个基于DNA生物传感技术，还有真菌核糖体分型技术建立起来的真菌检测DNA传感器检测系统，有效地缩短了检测时间，传统的检测方法需要3d左右才能全部完成诊断工作，而该系统将诊断时间缩短至6h，为病原微生物的分型研究提供了全新的思路[5]。

2 以扩增为核心发展起来的分子诊断技术

2.1 随机扩增多态性DNA技术的应用进展 作为一种核苷酸引物，可在基因组DNA区域中起到扩增PCR的作用，这是RAPD最为显著的作用，但是对温度提出了较高的要求，必须处于低复性温度之下，且基因组DNA区域必须拥有较高的同源性[6]。因为，菌株之间存在一定的差异性，所以任意引物杂交的位置也会因为菌株之间的差异而发生变化，数目也不相同。从理论上讲，模板任意引物杂交可形成特定的图谱。要想在检测过程中了解菌株基因组DNA的特点，必须善于利用脉冲场凝胶电泳，这是利用多态性检测反映出不同菌株特点的重要举措[7]。从某种角度来说，基于脉冲场凝胶电泳进行的多态性检测是一种用于DNA分型的重要手段，在菌株分子分型鉴定中起着极为重要的作用，也是分子诊断技术的发展趋势。经诸多实践证明，随机扩增多态性DNA技术拥有简便且快速的特性，但是其重复性有待提升，并对聚合酶类型提出了较为苛刻的要求，只有在规定量的DNA浓度或质量中才可使用[8]。

2.2 数字PCR技术的应用进展 数字PCR技术的研究与应用，逐步实现了绝对定量样品的目标。该技术主要是通过微球乳糜液化的作用，将乳糜液成功的分散至芯片微孔当中，每个芯片微孔当中至少有一个核酸模板的存在[9]。然后利用恰当的试剂和染料对芯片微孔释放的荧光信号进行检测。这样做的目的是判断反应体系中是否有靶核酸模板的存在，有把核酸模板的芯片微孔会在检测过程中释放出相应的荧光信号，通过对两种信号的数目和比例进行统计后，即可明确绝对定量[10]。从本质上来说，数字PCR与定量PCR之间存在极大的不同，最为突出的就是数字PCR摆脱了定量PCR必须应用标准曲线的难题，且不会对模板Ct值产生过多地依赖，并在绝对定量当中起到了极为重要的作用。灵敏度较高，准确度良好。当前，微滴式数字PCR已经得到了大面积的应用，并以商品化的形式应用于多项临床领域，例如牛丘疹病毒、口腔病毒还有巨细胞病毒的检测当中[11]。

2.3 核酸适配体技术的应用进展 经过不断的实践和发展，核酸适配体技术的应用范围越来越广，现已成功应用于临床诊断当中，临床治疗也有核酸适配体技术的身影。所谓核酸适配体技术，就是利用必要的手段寻找寡核苷酸片段，这种片段可以是蛋白或者酶，也可以是小分子物质，其具备亲和力较高的特征，需要在随机寡核苷酸序列库中进行反复的筛选，筛选时多使用配体系统净化技术[12]。该技术主要由扩增、调节、分离等5个步骤组成，还有结合和洗脱。虽然，每个步骤都相当重要，但是最为核心的就是分离，这也是适配体靶分子筛选的关键环节。适配体的特征相当明显，拥有较高的特异性，亲和力较强，靶标范围极为广泛，修饰较为简单。可大面积应用于某种特定蛋白的适配体当中，核酸的适配体也可对其进行使用。不久的将来，适配体系统进化技术极有可能完全取代抗体，但是现有的技术仍旧无法达成抗体取得的成就，在适配体种类方面仍有一定的局限。但是已经有学者对核酸适配体技术的应用提出了全新的思路，无论是特异性传递系统，还是基因治疗，都为核酸适配体技术的应用与发展指明了确切的方向[13]。

3 以序列为核心发展起来的分子诊断技术

高通量测序主要由3个部分构成，分别为第二代边合成边测序、第三代单分子测序和第四代纳米孔测序技术[14]。高通量测序的特征十分鲜明，优势也较为明显，可应用于大样品当中。但是其专业性较强，对操作人员的技术水平和实践经验均提出了较高的要求。无论是在结核病的早期分型和计算分析当中，还是对耐药基因进行的研究，都可利用高通量测序。可见，高通量测序在病原微生物检测中做出了突出的贡献。在不断研究与深化的过程中，基于杂交而发展起的扩张分组技术极有可能被高通量测序所取代，用于预防流行性疾病的爆发与恶化。

如今，第二代测序技术已经取得了极为显著的成就，并在不断运行过程中形成了完善且成熟的测序技术。但成本昂贵的问题并没有得到改善，甚至会在测序过程中出现低级错误，这也是制约第二代测序技术推广的直接因素。在第二代测序的基础之上，第三代测序技术完成了测序时间和成本的改善，且将单分子测序的目标落实到了整个检测工作当中。但是过于昂贵的仪器成本和数据分析等因素，仍旧制约了第三代测序技术的推广与使用[15]。纳米孔测序技术就是指第四代基因测序技术，该项技术可以说是以下两种技术的结合，也就是单分子检测技术，还有电子信号检测技术。虽然说纳米孔检测技术拥有极强的优势，并进行了多次实践与使用，但是还未形成成熟的运行体系，并未进入商用阶段。

4 讨论

虽然，分子诊断技术在诊断效率和结果准确性方面占据无法比拟的优势，但是其应用范围仍旧不如传统的检测方法。就目前来看，大多数食源性病原微生物检测和医学性病原微生物检测仍然依靠传统的检测方法，这不仅是因为传统的病原微生物检测相对可靠，还因为新兴的分子诊断技术存在试剂成本高、仪器价格昂贵等多种局限。如今，只有国家级科研机构或者海关开始应用分子诊断技术，大多数基层单位还是使用传统方法进行检测。值得注意的是，现阶段仍然没有一种单一的分子诊断技术，可满足高灵敏度和自动化等多项要求。可见，不仅要克服分子诊断技术在推广与应用中的不足，还要利用多学科联用的方式提高分子诊断技术的自动化水平。这有助于病原微生物检测取得更为理想的成果，并朝向自动化的方向发展。在多个部门和各级研究人员的努力之下，新型分子诊断技术一定会实现高通量、多组学联合判断的目标，更好地作用于病原微生物检测中。