实时荧光定量PCR技术及其在肿瘤研究中的应用*

高 纺 李 丹 余新雅

安徽中医药大学 1 中医学院 2 门诊部 3 针灸推拿学院，安徽省合肥市 230038

随着时代的快速发展，先进的科学研究技术层出不穷。1987年，科学家Kary Mullis发明的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术得到了生命科学界的一致认可，并于1993年获得诺贝尔化学奖。从此，PCR作为一种先进的研究技术，广泛应用于生命科学研究，然而传统的PCR技术在研究中只能进行“定性”分析，不能进行准确的定量研究，从而在临床应用中受到很大限制。而实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是在传统PCR技术的基础上，加入荧光基团，融合了传统PCR高灵敏度，DNA技术的高特异性以及光谱技术的准确定量等优点，克服了PCR技术不能定量研究的缺点，同时具有高灵敏性、特异性、准确性的一种定量研究技术，能够更早地做到肿瘤基因早期诊断[1]，已经成为医学分子生物学中重要的研究技术之一。目前该技术已逐渐成为医学肿瘤研究中的重要手段，将在未来肿瘤发病机制研究中占有重要位置。本文就qRT-PCR在肿瘤研究中的应用做一简要综述如下。

1 qRT-PCR技术概述

1.1 原理 qRT-PCR技术是以传统的PCR技术为基础，将荧光基团加入PCR反应体系中，通过荧光信号长时间累积进行的检测，最后通过标准曲线进行定量分析。在qRT-PCR技术中，Ct是指PCR技术检测的过程中，荧光信号达到设定的荧光阈值所循环的次数，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

1.2 特点 相对于传统PCR技术，qRT-PCR技术具有高灵敏度、高效率、高准确性等优势。qRT-PCR技术将传统的PCR技术、荧光标记技术和激光技术进行融合，提高检测的灵敏性；可在数小时内完成多个样品的实时定量分析，大大地节约了医务工作者的时间；采取针对性的靶序列鉴别定量分子，极大地提升了物体的特异性，提高实验的精确度。

1.3 分类 qRT-PCR技术可以分为荧光探针和荧光染料，都是检测扩增产物的增加量，使扩增的荧光分子信号与PCR产物的增加相一致。荧光探针是通过分离报告荧光基团和淬灭荧光基团，监测扩增的DNA链所形成荧光分子；荧光染料是在PCR技术过程中，加入荧光染料，使荧光染料渗入DNA双链，从而检测出荧光信号。

2 qRT-PCR技术在肿瘤中的应用

实时荧光定量qRT-PCR是一项新型的检测技术，该技术的应用能够使检测从之前的“定性”转变化为“定量”，而且具有强特异性，提高了检测准确性，其操作简便，基本能够实现自动化，临床上广泛运用于肿瘤基因表达的检测。肿瘤的实质是指人体细胞内的基因发生异变，是一种基因发生改变的疾病，这些不同的改变用荧光实时定量PCR技术都能够检测出来。尤其近年来qRT-PCR技术在预防、诊断以及治疗肿瘤发生率较高领域(肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等)方面最为盛行。

2.1 在肺癌相关特殊基因表达的临床检测 ZXF1在肺腺组织中的异常表达与肿瘤分化程度及淋巴结转移有密切关系，在临床中，其高表达可推测患者预后较差，并推断ZXF1可能通过增强靶蛋白BMP-5和SCFR的表达而影响肺腺癌的进展，临床运用qRT-PCR能够灵敏精确地检测ZXF1 mRNA的表达量[2]。表皮生长因子受体(EGFR)基因作为药物治疗肺癌的重要靶向基因，运用qRT-PCR法检测EGFR的异常表达，具有易操作、快速高效、灵敏精确，且超低成本等优点，有益于临床推广[3]。王晓楠等[4]为了寻找高效的检测肺癌早期诊断手段，收集肺鳞状细胞癌患者28例，正常人10例，结果显示，肺鳞癌患者与正常人外周血的鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)有差异，且具有统计学意义。表明了RT-PCR技术通过检测肺鳞癌SCCA1 mRNA基因的表达水平，用于肺鳞癌患者的早期诊断，具有较高的临床应用价值。杨上英等[5]通过对非小细胞肺癌(NSCLC)患者HLJ1基因进行qRT-PCR分析，显示HLJ1基因在NSCLC患者癌组织的表达明显低于癌旁组织，其差异有统计学意义(P=0.000)，结果表明qRT-PCR技术能准确检测出HLJl基因在肿瘤组织中呈降低的趋势，HLJl基因可能在NSCLC的发生发展过程中有着重要作用。王逸飞等[6]应用qRT-PCR技术检测原发性肺腺癌患者基因变化情况，探讨克唑替尼临床运用治疗，结果发现克唑替尼对于肺腺癌有着较高的控制率，表明了qRT-PCR技术通过检测肺腺癌，能够指导克唑替尼临床应用。 以上在临床检测中运用qRT-PCR技术能够更好地有助于肺癌的诊断与治疗。

2.2 在肝癌相关特殊基因表达的临床检测 甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，是白蛋白家族中一种，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。胎儿期，甲胎蛋白血液循环中具有较高的浓度，出生后则逐渐下降，到2～3个月后甲胎蛋白基本被白蛋白替代，血液中较难检出，故在成人血清中含量极低。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测[7]。miRNAs除了在肿瘤组织表达外，在外周循环血液中，分泌尿液中，胸膜水中等也有所发现，且化学性质稳定，能够持续监测。因取血运用qRT-PCR技术检测操作简单且创伤小，故有望作为肿瘤早期诊断标志物，而血清中miR-493-5p或miR-125b联合AFP对肝细胞肝癌的诊断比两者单独使用更具有灵敏性和特异性，对早期诊断原发性肝细胞肝癌具有潜在的临床意义[8-12]。另外运用qRT-PCR技术检测血浆中的高尔基体蛋白73(GP73)、长链非编码RNA(Long-chain non-coding RNAs,lncRNAs)HOTTIP和ROR在AFP阴性肝细胞癌中的诊断评估肿瘤细胞是否发生转移有重要的临床意义。因为早期肝细胞癌患者临床症状不明显，借助影像学和肿瘤单独标志物易漏诊，一旦发现已经处于晚期阶段，丧失最佳治疗时机，降低临床生存率。所以运用qRT-PCR技术增加血浆中具有明显变化的生化指标的检测能够提高AFP阴性肝细胞癌的早期诊断[13]。

2.3 在胃癌相关特殊基因表达的临床检测 癌胚抗原(Car-cinoembryonic antigen,CEA)是一种具有人胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，胚胎期主要在胃肠道等器官，出生后含量很低，是一种广谱的肿瘤标记物。其临床主要检测手段为qRT-PCR，对其实时定量检测在血清中的浓度含量，用于肿瘤的鉴别诊断、病情监视、疗效判断等方面。糖类抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)属低聚糖肿瘤相关抗原，为一种新的肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质。是血液中胃肠道肿瘤相关敏感抗原之一。如刘羽等采用qRT-PCR技术检测胃癌患者外周血中CEA的高表达，与正常患者相比，具有显著的统计学意义[14]。丽敏等检测外周血中CEA、CA199、CA72-4、CA125等四种肿瘤标志物时，采用qRT-PCR扩增人端粒酶反转录酶基因段，然后再进行电化学发光法检测大大提高了特异性和灵敏性[15]。qRT-PCR在胃癌生化检测方面应用广泛，除了以上经典指标外，如应用qRT-PCR技术检测胃腺癌和正常胃黏膜组织SIX6 mRNA及miR-203的表达，结果显示，胃腺癌组织SIX6 mRNA基因的表达明显增高，在一定程度上调节肿瘤的形成和发展，表明了SIX6蛋白的表达与胃腺癌预后有关；在胃癌组织中，miR- 203处于低表达状态，影响胃癌患者预后[16-17]。

2.4 在乳腺癌相关基因表达的临床检测 乳腺癌是女性常见并且多发的恶性肿瘤之一，与乳腺癌密切相关的肿瘤标志物有CA153、CA125、CEA、CA199等。这些肿瘤标志物在监测乳腺癌病情进展，以及了解治疗的疗效方面起着重要的作用，对于乳腺癌的诊断也起到一定的辅助诊断作用。但仅仅通过这些肿瘤标志物是不能确诊的，生化指标往往是通过多种联合方式，借助于影像技术手段，综合考虑并确诊。而联合qRT-PCR技术监测乳腺癌相关基因表达有助于临床诊断。 Mattie等[18]认为高通量qRT-PCR技术的出现，使miRNA成了一个独立参数，能够在活检组织中检测出ErbB2 miRNA的阳性与阴性，表明ErbB2 miRNA可以作为新的肿瘤标志物，应用于乳腺癌这样活检标本小的肿瘤。苏谦等[19]应用qRT-PCR检测血清miR-598-3p的表达水平，用化学发光法技术检测血清CA153的水平表达，二者联合检测能够提高诊断乳腺癌的敏感性和特异性。

2.5 在宫颈癌相关基因表达的临床检测 人乳头瘤病毒(HPV)是一种球形DNA乳头瘤空泡病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。有研究表明，患有宫颈癌的女性中感染HPV病毒的比例占到90%以上，大部分人都是感染HPV病毒导致的宫颈癌。所以现代医学对于HPV预防与检测显得尤为重要。qRT-PCR是当今较流行的一种监测技术，用于指导临床诊断。如贾政军等[20]采用qRT-PCR技术检测 HPV mRNA 表达量，其表达量随着宫颈癌的发展增加，呈正相关性，故可作为临床检测患者病情的发生发展及术后治疗等指导依据。陈刚等[21]认为qRT-PCR是一种临床检验技术，其对HPV-DNA的表达水平检测可广泛应用于临床筛查宫颈癌预防与诊断的首选方法。临床上，也可用qRT-PCR检测宫颈癌鳞状细胞癌中HIC1基因表达，结果表明qRT-PCR对于宫颈癌HIC1基因检测具有准确度高的特点，针对该疾病早期诊断、癌变分型、预后判断，HIC1基因的准确检测有着重要的意义[22]。

3 结语与展望

传统的PCR技术有cDNA与差异显示两大高通量技术，但是缺乏定量分析， 而qRT-PCR技术能够解决这一问题，使检测结果经过定量分析，从而得到差异性表达。肿瘤基因的突变和表达量的增加，在许多癌症早期就出现。qRT-PCR技术不仅能有效地检测出基因突变，还可以准确地检测基因的表达量[23]。因此，qRT-PCR技术在临床上具有广泛的应用价值，能够在肿瘤早期诊断、癌变分期分型过程中起到重要的检测作用。有研究发现[24]，与传统的DNA及mRNA表达的诊断方式相比较，通过qRT-PCR技术检测miRNA，在时间与准确性上都能更好地发现并提示癌变。同时，miRNA作为重要的肿瘤抑制基因或癌基因，qRT-PCR技术还可以为癌症的治疗提供检测手段，特异性敲除癌基因miRNA，从而抑制肿瘤的生长。目前，端粒酶hTERT基因、ER基因、MDRI基因等都能用qRT-PCR技术检测，尽管肿瘤疾病的分子机制改变尚未明确，但基因的遗传学异变则是肿瘤发病的根本原因之一，已得到普遍承认。

随着研究技术方法的不断创新、改进与完善，qRT-PCR将会在未来临床疾病诊断、前沿科学研究等领域拥有广阔应用空间及重要的地位，是生命科学研究中一种不可或缺的研究技术，该技术将于分子生物学、基础研究医学、疾病诊断、食品安全、药物开发等一系列领域中得到更加广泛的应用。