中药材内生真菌应用研究进展

王晓玥，张丽红，范 娜，童明琼

(德州学院 医药与护理学院，山东 德州 253023)

现阶段人民生活节奏普遍较快，工作压力大，人类健康正遭遇前所未有的挑战，发病率的增高使得我们对药物的需求量逐渐增大。中医药在我国应用历史十分悠久，中药材物种丰富，具有多种药理活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗炎、对心脏血管系统起效等。中药包括植物药、动物以及矿物等，其中植物药占比最大，如《中药大辞典》中收录的中药种类近6000种，植物药占80%以上，因此有“诸药以草为本”的说法[1]。天然产物是指从生物体内的多种内源性的天然存在的化学成分及代谢产物[2]，中药材治疗过程中发挥药理作用的有效成分是天然产物来源的宝库。中药材中天然产物呈现生物活性多样化及多靶点等特性，是现在新药研究的一大热点。然而多种天然产物现今仍主要提取自野生药用植物，随着发病率上升，药物需求量增大，采挖量的增加导致药用植物资源急剧减少，阻碍着中药材及天然产物的应用和发展。中药材内生真菌可能含有与中药材同样的代谢产物，产量高，并且具有良好的可再生性，因此从中药材内生真菌中寻找能够产生活性天然产物的菌株具有重要价值。

1 中药材天然产物的应用及局限性

中药材在多种疾病中具有良好的治疗效果，如中医药在癌症的治疗上已经起到了非同小可的作用。现在研究表明，多种中药材具有抗肿瘤治疗、提高免疫力及治疗耐受性、避免手术，延长生存时间的独特优势，可以从多个方面控制疾病。如紫杉醇是抗癌天然产物中的明星药物，其主要作用于微管，通过破坏癌细胞的有丝分裂过程，进而起到阻止癌细胞无限增殖的作用，临床上主要用于治疗乳腺癌等多种癌症[3]。再如传统中药材雷公藤，现在也会被用于肿瘤的治疗，现代研究表明其中含有的雷公藤红素可以抑制癌症新生血管生成[4]，是一种十分具有研究前景的天然产物。除此之外，雷公藤红素还有多种药理功能，包括抑制动脉粥样硬化斑块形成[5]、抗艾滋病毒[6-7]、治疗类风湿性关节炎[8]、改善肥胖哮喘气道炎症等。

由此可见，中药材的天然产物可以用来治疗多种疾病，很多天然产物处于供不应求的状态。现阶段天然产物的获取方式具有极大的局限性，主要包括直接从植物中提取，人工合成，半合成及组织培养等。多种天然产物主要提取于中药材，然而中药材中有效化学成分含量往往较低，若仅依赖于从中药材中提取天然产物，需要大量砍伐药材资源，可能导致物种濒临灭绝，破坏物种多样性。同时，为保证药用成分含量的积累，多数药材需要多年种植才能采收，进一步限制了天然产物的应用。许多天然产物可以通过人工合成获得，但是天然产物化学结构的复杂性导致了工业合成的难度极大，所需经费高，人力物力浪费严重。半合成方法相对而言研究较为透彻，但是操作过程中仍然需要使用大量中药材，未能从根本解决药用资源匮乏问题。组织培养法建立耗时久，所需成本高，同时难以进行规模化生产。由此可见，寻找有效天然产物的获取方式十分重要。

2 中药材内生真菌分离意义

内生真菌是真菌生物多样性的重要组成部分之一。内生真菌生存于植物的叶和茎之中并能完成生活的周期的真菌，在植物体内普遍存在，但是它不容易被识别，对宿主植物不具有致病性，而是依赖共生的关系。宿主植物可以提供给内生真菌的生存所需的营养物质，内生真菌通过促进植物生长发育及进化过程等方式回报宿主植物[9]。如邹晖林等[10]将内生真菌液浇灌到铁皮石斛的盆栽中，进行了为期6个月的干旱培养，并观察记录其外形变化、存活率等指标。结果表明，接受了内生真菌灌溉的铁皮石斛苗比对照组长势要好，说明植物内生真菌可以帮助植物生长并增加其抗逆性。苏珍珠等[11]实验表明，将内生真菌稻镰状瓶霉接种于水稻种子，幼苗的株高及叶宽会显著增加，同时营养吸收相关基因活跃表达，说明植物内生真菌对促进植物的生长起到了积极的作用。

内生真菌除具有可促进宿主植物生长发育等作用外，还可以产生多种次生代谢产物。现阶段，在内生真菌中发现的产物包括抗病毒剂，抗氧化剂，还包括抑菌剂等。

3.1 产生与宿主植物相同的代谢产物

内生真菌生长过程中会产生大量次生代谢产物，同时可以通过基因重组获得的宿主植物的某些基因所产生与宿主植物相同的产物，因此内生真菌总代谢物相比宿主植物而言可能更为多样。程玉鹏等[12]总结了多种药用植物内生真菌的代谢产物规律，发现红豆杉内生真菌能够产紫杉醇，长春花内生真菌可产长春新碱，喜树内生真菌产物中含有喜树碱，以上成分均与原植物次生产物相同，且已经合成药物。此外，多种药用植物内生真菌正在进行研究。曹晓冬[13]等从滇重楼的根状茎中分离得到3株可以合成大量的甾体化合物的内生真菌。柯树炜等[14]从番木瓜植株的叶片、果实和茎中分离得到一株内生真菌为青霉属橘青霉，通过薄层层析等实验方法测定其代谢产物含有黄酮类物质。

3.2 产生新型结构化合物

近年来，植物内生真菌中分离得到了多种活性化合物，除与宿主植物相同的产物外，还发现具有新颖结构的天然产物[15]，主要包括生物碱、甾体及萜类等[16]。如Lu等[17]从黄花篱的内生真菌中得一种新的具有抗菌作用的吲哚类生物碱。徐振鲁等[18]对荒漠植物雾冰藜的内生真菌进行了分离研究，得到4个松萝酸结构类似物，其中有一个新的化合物，并且具有抗肿瘤活性。张武德等[19]从丹参细胞中分离出8个新型的化学成分，这些物质分别有抗癌，抗病毒，神经保护的作用。由此可见，内生真菌是新型天然产物挖掘与筛选的重要来源之一。

4 中药内生真菌药用价值研究进展

中药材药理活性多样，当中药材基原植物作为宿主植物时，其内生真菌产生的代谢产物可能具有同样的药理活性，对于疾病的治疗具有临床应用的前景。

4.1 抗氧化作用

生物体在生长过程中，体内不断产生自由基，如若不及时清除，过量自由基积累会对人类健康造成危害。现阶段，有多种内生真菌产物表现出良好的自由基清除及抗氧化的功能。潘峰等[20]从川贝母鳞茎中分离得到一株内生真菌，利用石油醚等四种有机溶剂提取的发酵产物表现出良好的自由基清除活性。郑帅等[21]从刺五加中分离纯化得到的内生真菌中提取代谢产物，其发酵液菌株BXPL6和CBR1对DPPH自由基有较强的清除活性。郑朝辉等[22]从黄芩内生真菌的乙酸乙酯培养物中提取到的邻苯二甲酸二正丁酯等三种成分对自由基的清除能力也非常高。内生真菌发酵产物抗氧化能力与培养条件及时间相关，如崔晋龙等[23]在柴胡红景天中研究一株命名为菌Rb-R-1的内生真菌，发现在含有乳糖及牛肉膏的培养基中，中性pH值条件下，25 ℃培养10 d时，发酵产物对DPPH的清除率达到最高值。

4.2 抗癌抗肿瘤作用

近年来癌症发病率的上升极大地危害了人民健康，抗癌抗肿瘤活性物质的筛选迫在眉睫，内生真菌为寻找抗癌天然药物提供了新的思路，多种抗癌活性产物被发现。如陈淑娟等[24]从红豆杉内生真菌的发酵产物中分离出一种化合物经过检测，对恶性黑色素瘤细胞有一定的抑制作用，且与浓度呈正相关。杨明俊等[25]从水仙根茎中的内生真菌分离真菌并对其进行检测，发现使用乙酸乙酯提取的内生真菌发酵液可以抑制肝癌细胞HepG2细胞的生长，同时对金黄色葡萄球菌等细菌同样具有抑制作用；铁皮石斛内生真菌的乙酸乙酯萃取物具有类似药理作用[26]。

宫颈癌严重危害了女性健康，缪莉等[27]使用乙酸乙酯萃取了银杏内生真菌的发酵液并鉴定得到，分离出四种化合物，发现其中一种化合物羟基曲霉酸，MTT实验证明该成分可抑制HeLa细胞生长；陈吴海等[28]提取和纯化了藏红花内生真菌CSL-27的多糖成分，同样发现在多糖浓度为0.5 mg/mL时对HeLa细胞的增殖有抑制性。代金霞等[29]对宁夏枸杞的内生菌资源进行筛选，发现4株内生真菌对肿瘤的抑制率高于50%。研究表明，雌激素受体的转录途径与包括乳腺癌在内的多种疾病相关，异常表达会影响代谢通路导致疾病的发生，疾病水平积累会导致雌激素受体的消亡，因此临床上常使用雌激素受体激活剂进行治疗。廖祖健等[30]研究了金线莲的内生真菌的代谢产物，发现三种产物可特异性转录激活雌激素受体，后续试验证明其可抑制某些癌细胞增殖，对其深入研究有成药潜能。民族药是我国中药的重要组成部分之一，是少数民族人民智慧的结晶，在临床应用中发挥了重要的功能。黄益[31]分离了藏药大花绿绒蒿的4种内生真菌，通过体内和体外实验证明其均具有一定的抗肿瘤活性，且活性与结构之间存在相关性。

4.3 抗菌抑菌作用

微生物的多样性对地球生态环境的维持至关重要，然而某些病原微生物的生存会危害到其他生物的健康。研究表明，某些内生真菌的活性产物对病原微生物会起到抑制作用。王营等[32]对从广藿香多部位分离得到的内生真菌发酵液进行抑菌试验检测，发现至少20种内生真菌具有抗病原菌活性。抑菌试验中常使用大肠杆菌作为供试菌，作为产物的抑菌效果的指标。张慧茹等[33]将绞股蓝内生真菌发酵液加入生长中的大肠杆菌培养液中，观察到大肠杆菌的形态发生了严重的破损，蛋白质合成异常，说明绞股蓝内生真菌对大肠杆菌有抑制性；王利梅等[34]从金叶女贞中分离内生真菌，以大肠杆菌等为试验指示菌株，经测定一半以上的内生真菌有抑菌性。也有研究使用其它常见病原菌作为指标，刘雷等[35]对川麦冬进行分离得到内生真菌，经测试发现分离的菌株对白色念珠菌具较强的有抑制活性。张维瑞等[36]研究发现杜仲中分离得到的内生真菌可产生绿原酸，且发现1株内生真菌对芽孢杆菌抑制率高达到80%。刘艳明等[37]筛选具有抗炭疽病活性的铁皮石斛内生真菌的菌株，发现其中三株真菌的平均抑菌率高达85%以上。除此之外，对植物病原菌的抑制性也有报道，卿朕等[38]分离了广西地不容的内生真菌，用有机溶剂提取发酵产物，发现该产物使烟草黑胫病菌可溶性蛋白含量降低，说明对其有抑制性。何应红等[39]提取青蒿中的内生真菌，以五种常见的猕猴桃病原作为指示菌，研究发现，50%以上的内生真菌对其都有抑制性。

4.4 其他药理作用

药用植物内生真菌还可以产生增强免疫力、治疗糖尿病等治疗作用的活性物质。焦志强等[40]以植物绞股蓝内生真菌发酵液中提取的胞外多糖为研究对象，通过体外实验研究对肉鸡的影响，发现在饲料中添加胞外多糖，可以使肉鸡消化能力加强，提高细胞免疫和体液免疫的能力，从而增加经济效益。徐祥林等[41]对罗汉果内生真菌的分离鉴定，发现提取物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶有较好的抑制活性，说明它可以制成抗糖尿病药物。

5 总结与展望

自古至今，中药材在疾病治疗方面一直发挥着其不可替代的作用。中药材的疗效归功于其中含有的天然产物。现阶段，许多天然产物已在临床使用，如紫杉醇、鬼臼毒素、喜树碱等。然而多种天然产物由于获取途径的局限性，产量仍然较低，极大阻碍了中药材及天然产物的应用和发展。中药材内生真菌因其可能含有与中药材同样的代谢产物、产量高、可再生性强等特性，在活性天然产物的开发和获取方面具有重要价值。一方面可以解决现阶段中药材资源匮乏问题，另一方面可以提高药物产量，降低成本及药物售价，造福患者。然而，现阶段仅有极小部分内生真菌资源被开发，许多资源尚处于研究空白状态。同时，仅有不到5%的真菌可在现今通用的培养基上生长，极多菌种无法分离得到，人类对微生物世界知之甚少。随着分子手段的革新，可将高通量测序技术与内生真菌的分离相结合，更好的分析微生物群落结构；并加强微生物培养手段的革新，发掘更多内生真菌，为进一步丰富人类对中药材内生真菌的认识打下坚实基础，为疾病的治疗提供更多途径。