外泌体源性miRNA在消化道肿瘤中的研究进展

曾 凯综述，许利剑审校

0 引 言

消化道肿瘤是一种常见的恶性肿瘤。随着中国居民预期寿命的延长以及生活环境、生活方式和饮食习惯的变化，消化道肿瘤的发病率逐年上升。胃癌发病率占我国肿瘤发病率的第2 位，结直肠癌为第3 位；胰腺癌则是癌中之王，一旦发现，患者往往已经进入晚期，愈后极差［1］。因此，进行有效筛查和早期诊断治疗是目前临床关注的热点，寻找消化系统疾病特异性生物学检测指标已成为当务之急。目前，由于具有易于检测、稳定性好等优势，外泌体源性miRNA 被视为具有潜力的生物学检测指标［2］。本文外泌体源性miRNA 在消化道肿瘤中的进展作一综述。

1 外泌体源性miRNA的概念和生物学特性

1.1 外泌体的定义细胞通过微泡结构选择性地包裹蛋白质、RNA 等物质，并将其释放到细胞外的环境中［3］，包裹了RNA 和蛋白质的小微泡（30～150nm）即称为外泌体［4］。在正常生理及病理状态下，多种细胞均可向外分泌外泌体，通过多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中［5］。其内部成分与其分泌细胞的来源和机体的病理生理状态有关。

1.2 miRNA 的定义微小RNA（miRNA）是在真核生物体内发现的短序、内源启动的非编码RNA，由大约21-25 个核苷酸组成。长初级转录物被一系列核酸酶切割形成成熟miRNA，从而在基因表达和mRNA 翻译转录的控制中起特定作用［5］。miRNA 的调节网络很复杂，单个miRNA 可调控多个基因表达，多个miRNA 的组合也可调控单个基因表达。miRNA 能够将mRNA 链切割成两条，阻断核糖体将mRNA 翻译成蛋白质［6-7］，目前确定作用包括参与细胞生长和组织分化的调节［8］，而这两个过程的失调会直接导致癌症的形成和发展［9］。大量研究表明人体miRNA 表达谱的特定变化与特定的肿瘤表型相关，并且大多数定位于基因组上与肿瘤相关的脆性位点，发挥类似肿瘤抑制基因和癌基因的作用［10］。

1.3 外泌体源性miRNA 的定义外泌体含有多种短链和长链RNA，其长度、类型和含量随细胞状态的变化而变化。目前，在外泌体中发现了4934 种miRNA，这些外泌体中包含的miRNA 被称为外泌体源性miRNA。外泌体源性miRNA 作为临床检测指标有着极大的应用价值。首先，miRNA 的化学性质较蛋白质来说更为稳定，且血清中的miRNA 可逃脱核糖核酸酶的消化［11］。此外，由于外泌体源性miR‑NA 对比其他来源的miRNA 具有明显优势，检测外泌体源性的miRNA较直接检测miRNA更适合。

1.4 外泌体源性miRNA 的生物学特性外泌体源性miRNA 对比其他来源的miRNA 具有以下优势：①易于检出，Emming 等［8］研究发现，血清和唾液中miRNA 的表达主要来自外泌体，即在天然体液（如尿液、脑脊液、乳汁等）中检测到的miRNA 多为外泌体源性miRNA［12］；②不易降解，由于一些miRNA 在循环中与蛋白结合成复合物，部分复合物能够存在于外泌体内容物中，使得miRNA 在循环中能够保持活性和稳定以防止被降解。丰富的miRNA 确实存在于循环中的外泌体内，且大都跟RNA 诱导沉默复合体蛋白结合形成复合物而存在。Yan 等［13］通过分析结直肠癌血清中miRNA 证实了被外泌体包裹的miRNA 在人体循环中具有更好的生物学稳定性。③作为有效载体，细胞能通过释放微泡将生物活性脂类、核酸、蛋白质等物质转运至靶细胞，从而调节靶细胞的活动，发挥抗凋亡、促进增殖、抗菌、抗肿瘤、促血管生成、诱导细胞分化和调节免疫等作用［14］。总之，由于其独特的囊泡样结构，外泌体不仅可保护miRNA 免于降解，还可作为将其运输至靶细胞的有效载体。

2 外泌体源性miRNA的检测

2.1 外泌体的分离纯化为测得血浆、尿液、唾液、粪便中的外泌体源性miRNA，首先要分离和富集样本中的外泌体。外泌体分离技术种类较多，传统的分离技术包括超速离心、超滤、沉淀以及基于免疫亲和的外泌体分离提取方法，新兴的分离技术包括纳米粒子追踪分析，电化学外泌体定量法，表面等离子体共振，微流控技术，光敏磁珠检测［15-18］。目前最常用的是超速离心，该方法得到的外泌体量多、成本低，但是回收率低、纯度不足。而超滤法回收率较高，但过膜易损耗变形。其余各方法由于价格昂贵，成本较高，效率较低等局限性，尚未大规模应用。因此，在诊断领域中应用外泌体来进行检测需要解决的首要障碍是确立最优的方式及建立标准去分离提纯外泌体［18］。

2.2 外泌体源性miRNA 的检测目前外泌体中的miRNA 检测一般是基于核苷酸杂交和扩增原理。通过Northern blot、微阵列芯片、实时聚合酶链锁反应（RT-PCR）、电化学检测等检测手段，将分离纯化后的外泌体中的miRNA 的杂交信号转化为可测量信号。RNA 核酸杂交技术由于样品需要量大、耗时长、灵敏度低等缺点，目前使用较少［19］。微阵列芯片技术的优点是高通量，但会受到miRNA 家族中与其类似的序列交叉杂而交造成灵敏度下降。实时聚合酶链锁反应具有较高的灵敏度和实用性，但由于miRNA 自身的限制，对引物的设计要求很高且温度难以控制，仅在实验室使用较多。电化学生物传感器相对于其他几种方法来说，能耗低并且易于集成化，能够高效、灵敏的应用于大批量的miRNA 检测，且能较为迅速地获得检测结果。因此，基于电化学技术的miRNA 生物传感器在实验诊断领域有极大的应用前景。

3 外泌体源性miRNA 在常见消化道肿瘤中的研究

消化道肿瘤临床确诊的金标准是组织活检。尽管组织活检具有高精度和高可靠性，但侵入性和高成本使得对于肝、胆囊、胰腺的活检很难进行，尤其是胰腺处于腹膜后位，侵入性活检对患者造成创伤较大。粪便潜血试验和结肠镜检查作为筛查方法可降低结直肠癌的死亡率［2，20］，但这些技术有灵敏度低、创伤性和不适感等局限性。CA19-9和癌胚抗原已被广泛用作肿瘤标志物，不足之处是这些标志物的检测对消化道肿瘤的敏感性和特异性还不够高。因此，找到简便易行可靠的消化道肿瘤的生物标志物显得有意义。综合研究发现，外泌体源性miRNA 与食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌关联较大，而与胆囊癌、小肠癌等关联较小。

3.1 胃癌黄声凯等［21］检测了21 例胃癌、结直肠癌患者血清中外泌体源性miR-378 和miR-21 的表达，与健康对照组比较结果显示，miR-378 在胃癌患者血清中表达下降而miR-21表达升高。研究发现，miR-21 可通过下调Serpini1 的表达缩短细胞周期，加速细胞增殖，后者在调控细胞增殖、防止细胞癌变的过程中发挥着重要作用［22］。已知程序性细胞死亡基因4（programmed cell death protein 4，PDCD4）能促使细胞凋亡，而miR-21 能够通过下调PDCD4的表达，从而抑制细胞凋亡并间接促进胃黏膜上皮细胞的增殖［23］。除Serpini1 和PDCD4，人第10 号染色体缺失的磷酸酶、张力蛋白同源的基因和富含半胱氨酸反转录蛋白基因也是miR-21的直接靶基因，这些抑癌基因表达的下调促进了胃黏膜上皮细胞的癌变。miR-378 可通过负调控血管内皮生长因子和MAPK1 的表达起到抑癌基因的作用［24］，其下调的机制及其在致癌作用中的作用仍不清楚，但Deng等［25］的研究数据表明，miR-378 的表达受其上游启动子中的DNA 甲基化调节，miR-378 可分别通过负调节CDK6 和VEGF 的表达而在胃癌中充当肿瘤抑制剂。综上，通过ROC 曲线分析其诊断效能显示，将血清外泌体源性miR-378 和miR-21 水平联合应用作为胃癌诊断标志物有一定的诊断价值，灵敏度和特异度高达92.0%和87.0%，远高于癌胚抗原和CA-199［26］。Molina-Castro 等［27］研究结果还显示，胃癌患者血清miR-378的表达可作为选择肿瘤治疗方式（手术或是放化疗）的重要参数。虽然miR-378和miR-21 在结直肠癌和胃癌患者血清中的表达无明显差异，但是作为初步筛选胃和结直肠癌是非常理想的生物学指标。

3.2 食管癌miRNA-21 在食管癌细胞及其相应的外泌体中含量丰富。Liu 等［28］采用qRT-PCR 技术比较了食管癌患者和对照组血浆miR-93-5p 的表达情况，并通过建立细胞模型，研究miR-93-5p 对受体细胞生物学功能的影响。结果显示，血浆miR-93-5p表达上调显著增加食管癌的风险，并与预后不良相关。外泌体传递的miR-93-5p 促进受体食管癌细胞增殖，影响抑癌基因PTEN 及其下游蛋白p21 和cy‑clin D1 的表达。此外，也有研究表明RNU6-1/miR-16-5p、miR-25-3p/miR-320a、let-7e-5p/miR-15b-5p、miR-30a-5p/miR-324-5p、miR-17-5p/miR-194-5p 等生物标记的改变也与食管癌的发生有着统计学相关性。但是，目前临床上未有关于食管癌中特异性地表达外泌体源性miRNA的临床研究。

3.3 结直肠癌大量的临床研究均发现了结直肠癌中外泌体源性miRNA 的特异性表达。陶灵佳等［29］总 结 出miR-18a-5p、miR-21-5p、miR-29a-5p、miR-92a-5p、miR-143-5p 和miR-378-5p 在结直肠癌患者体内表达异常，认为可成为潜在的诊断标记物。另外有研究表明，8种miRNA（let-7a、miR-1224-5p、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a）在原发性结直肠癌患者的血清外泌体中显着升高，并且在行肿瘤根治术后下调，使用定量实时PCR 在独立样品组中验证了这些外泌体源性miRNA 在结直肠癌中升高。更有临床意义的是，在早期（TNM I 期）结直肠癌样品中miRNA 的差异性表达。Wang 等［30］表明在早期结肠癌患者血清外泌体源性miR-125a-3p 和miR-320c 明显上调，可对于原发性结直肠癌的早期检出有极大的帮助。

3.4 肝细胞癌外泌体源性miR-223 的表达下调与肝细胞癌相关，且具有特异性和高灵敏性。不管是血清还是活检病理组织，均出现下调。这表明了miR-223 可作为肝细胞癌潜在的无创生物标志物。Rui 等［31］报告指出，miR-223 在肝细胞癌中过表达，增加了抗癌药物在肝细胞癌细胞系中的敏感性。研究通过对在不同类型患者血清miR-223的表达及ROC 曲线分析，表明肝细胞癌患者miR-223 表达水平下调，同时进一步说明肝细胞癌患者细胞增殖调控紊乱［32］。另外值得注意的是，Xiao 等［33］的研究显示在不同感染类型的肝细胞癌患者中，乙型肝炎、丙型肝炎和诺如病毒组患者的miR-30e 和miR-223均出现显著下调，且下调幅度相似，表明血清miR-30e和miR-223不受肝细胞癌类型的限制，提示其可作为诊断的广谱型生物标志物，具有重要的临床诊断意义，因此后续可通过较大的队列研究进一步探究其诊断价值。

3.5 胰腺癌外泌体源性let-7a在体外和体内实验中均被证明能抑制胰腺癌细胞的细胞增殖、转移和化学敏感性，是负责肿瘤化学敏感性的CXCR4的下游靶基因［33］。Furusato 等［34］研究首先检测了各种胰腺肿瘤组织中let-7a 基因的表达水平，结果显示与正常胰腺组织相比，let-7a 在肿瘤组织中减少，该研究观察到let-7a与胰腺肿瘤组织中的CXCR4表达呈负相关，研究同时在两个胰腺肿瘤细胞Bxpc-3 和Panc-1 中 检 测 到let-7a 水 平，用100ng/mL SDF-1a（CXCR4 的同源配体）处理，let-7a 水平降低50%，表明CXCR4 有调节胰腺肿瘤细胞中let-7a 水平的能力。另一方面，用强效CXCR4 抑制剂AMD3100（200nM）处理的细胞后，let-7a mRNA 水平显著增加，let-7a 在体外增加了胰腺癌对于化疗药（吉西他滨）的敏感性。这提供了对胰腺癌细胞的发病机制和耐药性的更深入理解，并有助于开发更强大的治疗方法用于治疗胰腺癌。数据表明let-7a 在胰腺肿瘤细胞增殖，侵袭和转移中起关键作用，该研究认为CXCR4可能通过let-7a在胰腺细胞癌的发病机制中发挥作用，因此，let-7a 不失为一个潜在的诊断胰腺癌的特异性生物学指标。

4 结语与展望

由于多数患消化道肿瘤的患者在晚期时才能得到确诊，且总体预后较差，因此消化道肿瘤在所有癌症类型中死亡率较高［1］。临床实践表明，特异性生物学检测指标对于消化道肿瘤的早期诊断和治疗非常重要。本文综述了外泌体源性miRNA 与常见的消化道肿瘤的关系，并提出外泌体源性miR‑NA 作为临床检测指标有着极大的应用价值。虽然近几年外泌体源性miRNA 的研究越发火热，但基本上都取材于细胞培养液中的外泌体miRNA 进行研究，直接在患者体液中提取外泌体miRNA 进行的较少。大部分外泌体及其信号通路研究目前都只处于早期阶段，很多研究还仅限于细胞实验，在动物实验中需要进一步验证。相信不久的将来会有更多特异性的生物学指标被发现，使得患者在不经过侵入性检测的情况下做出消化道肿瘤的诊断，此外新的治疗策略（如囊泡介导的基因治疗）也是另一个富有前景的领域。