母乳外泌体载药用于新生儿相关疾病治疗的研究进展

姜承耀，陈文娟，陈小慧，王星云，余章斌，韩树萍

(南京医科大学附属妇产医院 南京市妇幼保健院儿科，南京 210004)

囊泡是一类人工合成或天然存在的纳米粒子，是极具吸引力的智能生物活性分子输送系统[1]。生物囊泡是一种脂双层天然纳米颗粒，外泌体作为其中一员是近年来的研究热点，在医学载药领域，除保护内容物免受破坏，传递酶类、遗传物质等外，还能介导细胞间信号转导；兼具人工合成囊泡的亲水、亲脂性能，且拥有更强的渗透性、靶向性及可改造性，能够促进药效在靶位稳定发挥；并利用其小粒径、脂溶、稳定的物理特性，使得药物借助外泌体更易被摄取[2]。总之，与脂质体、肽和其他纳米级药物递送系统相比，外泌体具有较好的循环理化稳定性，血脑屏障穿透力和生物兼容性，以及较低的毒性[3-5]。

母乳为婴幼儿生长发育提供了较为理想的物质基础。母乳中含有大量的外泌体，研究表明乳源外泌体能够增强肠干细胞活性，促进肠细胞增殖，保护肠道通透性及屏障功能，对新生儿坏死性小肠结肠炎(neonatal necrotizing enterocolitis，NEC)导致的肠损伤有保护作用[6-8]。母乳外泌体改造后的载药体，不仅拥有外泌体本身的独特优点，还兼具改造后功能[9]。参考相关研究，对外泌体表面标志物进行改造，获得组织细胞靶向性，增强细胞间信号通讯[10]；添加药物分子、遗传物质、蛋白质等外源性物质，可以融合利用内源性母乳固有营养物质，实现分子水平治疗[11-13]。现就外泌体载药和母乳外泌体生物学特性的相关研究进展予以综述。

1 外泌体载药

在医学载药领域，多肽、蛋白质、DNA等生物大分子治疗药物的稳定性差和吸收率低是普遍存在的问题，因此纳米囊泡载药体系应运而生。目前人工合成的纳米囊泡中，针对高分子聚合物囊泡与低分子脂质体的研究最常见[14]。然而，这些人工纳米载药体进入人体后，易引发自身免疫反应，从而被人体免疫系统清除；同时其靶向性差，因而载药效率不高且具有一定的毒副作用。近年来，外泌体作为天然生物囊泡的成员之一，因具有介导细胞间信号转导、抗原呈递和免疫应答等功能，兼具人工合成囊泡的小粒径、脂溶、稳定、高渗透性和可改造性等特点，越来越多地被应用于药物靶向递送，有望成为药物递送系统发展过程中的一项重要突破。

外泌体载药研究领域发展至今，药物载入方式也多种多样，包括被动方式和主动方式两类。被动方式可通过外泌体与药物共孵育或供体细胞与药物共孵育实现，两种方式均简单易行，不破坏外泌体膜的完整性[15]。已有研究将牛乳外泌体与紫杉醇共孵育得到外泌体-紫杉醇复合物，结果表明这种被动性纳米药物改造技术克服了口服化疗药物生物利用度差的限制，降低了用药总剂量，从而减少药物高剂量导致的毒副作用[16]。主动方式主要包括以下几种。①超声法：常用，高效，但破坏膜完整性，且存在“二阶段释放”效应，因载入的药物不仅被外泌体包裹，同时存在于外泌体外层膜中，致使药物释放分为两个阶段，附着于外泌体外层的药物于第一阶段释出，被外泌体包裹的药物于第二阶段释出；②挤压法：常用，高效，但破坏膜完整性，且产物存在一定细胞毒性；③冻融法：中效，能形成外泌体与脂质体的膜融合，但易形成聚集，导致较大粒径分布；④电穿孔：有利于载入小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)等较大分子物质，但易致RNA聚集及外泌体不稳定，降低载药量；⑤膜渗透剂孵育法：载药效率高，但具有细胞毒性；⑥点击化学法：快速高效，可控；⑦抗体结合法：具有特殊性，易于操作。无论哪种方法，外泌体膜完整性，改造后复合体的稳定性及载药效率均是衡量载药方式优劣的金标准[15]。有研究分别使用超声法、挤奶法、膜渗透剂孵育等方法，高效载入抗氧化过氧化物酶至巨噬细胞和单核细胞来源外泌体，后将复合物导入神经元和小鼠颅内，分别验证了其在帕金森神经元抗氧化模型和小鼠脑炎模型中的神经保护作用[17]。

2 母乳外泌体防治新生儿相关疾病

母乳能够有效预防NEC、支气管肺发育不良(broncho-pulmonary dysplasia，BPD)等多种新生儿相关疾病发生，其在生命早期具有预防过敏的潜力，但具体作用机制仍有待研究[18-20]。而外泌体作为近年来发现的母乳生物活性成分之一，在治疗NEC、BPD及过敏性疾病等新生儿相关疾病中也具有良好的应用前景。

相关指南提示母乳喂养能够减少新生儿NEC的发生，但作用机制不明[18]，为此，研究人员首先通过乳源性外泌体作用于大鼠肠上皮细胞，促进了肠上皮细胞的活力和增殖力，同时提高了肠干细胞的活性，提示外泌体可能是发挥抗NEC作用的关键[8]。后续进一步研究表明人母乳外泌体可以减轻过氧化氢处理肠上皮细胞导致的氧化应激，减少肠上皮细胞死亡，提示人母乳来源外泌体可能作为降低高危新生儿NEC发生率和严重程度的治疗工具[7]。Wang等[21]的研究发现早产儿母体的母乳来源外泌体可显著促进小肠上皮细胞增殖和迁移，对抗NEC损伤，部分恢复实验性NEC大鼠肠道上皮的增殖和迁移功能，提示母乳来源外泌体对肠道具有重要保护作用。

研究表明，母乳是多能间充质干细胞的丰富来源[22]。研究人员将骨髓间充质干细胞通过气道给药的方式干预高氧损伤模型组大鼠，发现大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡水平下降，促进了细胞损伤后修复，可能具有防治BPD的作用[23]。进一步向新生大鼠BPD模型腹腔注射骨髓间充质干细胞来源外泌体能保护肺泡化和血管生成的肺发育过程，保护高氧状态下新生鼠肺泡和肺血管的正常发育[24]。因此，母乳多能间充质干细胞外泌体对BPD可能具有潜在治疗预防功能。

世界范围内过敏性疾病的发生率在过去几十年中呈不断升高的趋势，针对新生儿过敏的研究也不断增多[25]。有研究从初乳和成熟乳中分离出外泌体进行功能分析，发现其抑制了抗分化簇3诱导的白细胞介素-2和干扰素的产生，同时增加了调节性T细胞的数量，证明母乳外泌体具体免疫调节特征，能够调节新生儿免疫系统的发育[26]。而母乳中的外泌体表型会随着母亲的过敏敏感性和生活方式的不同而变化，进而可能会影响新生儿过敏的发展[27]。此外，母乳来源外泌体能够结合被1型人类免疫缺陷病毒感染的单核细胞衍生树突状细胞，并抑制病毒随后向分化簇4阳性T细胞的转移，从而阻断1型人类免疫缺陷病毒的垂直传播，保护新生儿[28]。

母乳外泌体的miRNA以其特殊的作用一直是外泌体内容物研究的热点与重点[29]。母乳外泌体含量最高的miR-22-3p与免疫相关，其靶向转录因子7是Wnt途径中的一个重要效应分子，可增加肝糖异生途径中酶的表达，因此可作为治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的靶点[30]。突触形成、稳定性和可塑性是神经元发育的关键特征，研究表明对突触发育有积极影响的大部分miRNA存在于母乳外泌体中，提示母乳外泌体中的miRNA可能有益于生命早期的大脑发育[29]。

3 母乳外泌体载药在新生儿相关疾病防治中的作用

富集于母乳中的外泌体，因其自身细胞来源的脂双层结构，具备低免疫原性；且母乳外泌体作为药物载体，低毒或无毒，能够安全高效地携带药物到达靶组织，已成为极具应用前景的新型载药体。然而，与人工合成囊泡相比，外泌体虽然具有一定的靶向性，但由于其高度的复杂性和成分的多样性，作为载药体的应用仍缺乏普遍靶向性，可能产生脱靶效应，诱发不良反应；而且可溶性低，循环半衰期短，因此针对外泌体表面标志物的改造以获得靶向性一直是研究热点；此外，也有大量研究针对内容物进行改造，近年来主要以外源性的抗肿瘤药物、核酸分子、转录因子和酶类，内源性母乳多糖、低聚糖、多肽等为“货物”，将它们载入外泌体后运送到标靶位置[31-33]。对母乳外泌体进行载药改造，既保留了外泌体本身的特性，同时充分利用了功能性内外源物质，又可进一步优化外泌体的靶向性与稳定性，有望为治疗新生儿相关疾病提供新的思路和方法。

3.1对母乳外泌体表面标志物的改造 外泌体普遍获得靶向性的方式是转染其来源细胞使之表达靶向成分，然后这种成分与外泌体表面蛋白(如溶酶体相关膜糖蛋白2b)融合，从而获得具有特定靶向性的外泌体。如将鼠不成熟树突状细胞来源外泌体的溶酶体相关膜糖蛋白2b与整合素αv特异性iRGD肽(环状精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸肽)融合，获得整合素αv阳性乳腺癌细胞的靶向性[34]；或将树突状细胞来源外泌体的溶酶体相关膜糖蛋白2b与神经元特异性狂犬病毒糖蛋白多肽融合，获得脑部神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞的靶向性[33]。但此种靶向改造方式也存在一定的缺点：耗时且操作具有挑战性；一些靶向配体易发生不正确表达且易降解；容易产生非特异性结合，特异性差，靶向性程度低。还有研究通过“后插入效应”将纳米抗体、聚乙二醇与神经2A细胞或血小板来源外泌体三者结合，形成“纳米抗体-聚乙二醇-外泌体膜脂质”结构，大致解决了靶向改造的主要难点。其中，聚乙二醇可延长外泌体血液循环中的快速清除时间；而纳米抗体具有高度可溶性和特异性，可对抗极端化学条件[35]。以上研究提示，针对母乳外泌体的靶向性改造，可先根据治疗的需要，寻求合适的靶位受体，再通过转染、融合等改造方式使载有抗肿瘤药物、核酸分子、蛋白质及母乳多糖、低聚糖等“货物”的母乳外泌体-药物复合物获得靶向性，随后通过口服或静脉注射等方式给药，用以治疗NEC、BPD等各种新生儿疾病。

3.2对母乳外泌体内容物的改造

3.2.1外源性物质 多种癌细胞株来源的外泌体已被证明可作为导入化疗药阿霉素的载体，与直接用药相比，外泌体包裹阿霉素组成的复合体毒性更小，实验鼠能耐受较高药物浓度，乳腺癌与卵巢癌组织药物浓度更高，肿瘤组织减少更明显，同时能减少脱靶效应导致的心肌毒性[36]。有研究表明，将紫杉醇载入巨噬细胞来源外泌体，能够增强紫杉醇的肿瘤靶向性，从而抑制肺癌转移灶生长，提高对多重耐药癌细胞的治疗效应，为多种化疗药物治疗耐药癌症提供了可能[37]。值得注意的是，姜黄素，一种具有良好抗炎、抗癌作用的药物，低稳定性、溶解度和生物利用度大大降低了其作用功效，然而通过乳源性外泌体包裹的方式较好地克服了上述不足，在体外消化模型上相比单药能更加稳定地携带内容物穿过肠道屏障到达血液循环发挥药效[38]。

将特定siRNA导入外泌体并将其转入癌细胞，可导致选择性基因沉默，使其编码的RAD51(真核生物体内的一种蛋白质)重组酶消失，最终产生增殖癌细胞死亡的效果[39]。而研究人员设计出的携带siRNA或短发夹RNA的外泌体，能够针对胰腺癌中的常见突变位点KRAS，凭借其强大的靶向性以及内含的天然吞噬因子，较脂质体具有更高的治疗效力[32]。一项研究将乳源性外泌体负载siRNA后分别作用于血管内皮生长因子、表皮生长因子受体、蛋白激酶B、鼠类肉瘤病毒癌基因、促分裂原活化的蛋白激酶的特定基因，结果表明不同癌症中，siRNA通过外泌体运载后，其靶基因敲除效率升高2～10倍，并通过进一步实验证明了静脉注射siRNA外泌体复合体在裸鼠模型中的抗肿瘤活性，提示乳源性外泌体可用于递送siRNA进行抗癌治疗[40]。

另有研究首先利用小鼠干细胞病毒逆转录病毒表达系统将转录因子GATA-4(基因启动子中的一段保守序列，其核心碱基序列为GATA，具有调节转录活性的功能)导入大鼠骨髓间充质干细胞，使之分泌出GATA-4高表达的外泌体，该种转录因子的高表达能增加心肌的存活、减少凋亡，并且提高缺血心肌的血管形成，进而极大改善心功能[41]。后续将抗凋亡miRNA导入上一步的外泌体中，并将改造外泌体注射至左前降支结扎后心肌缺血区边缘，发现心脏收缩功能显著恢复，心肌梗死面积缩小[42]。此外，研究者借助室温孵育、皂苷渗透、冻融循环等技术将过氧化氢酶完整载入巨噬细胞来源的外泌体，随后以外泌体-过氧化氢酶复合物作用于神经组织，结果提高了神经元的存活率，减轻了脑部炎症反应，表明基于外泌体的酶类制剂可能是未来治疗神经退行性疾病有价值的工具[17]。

因此，可依靠外泌体优越的“生物兼容性”，将治疗性化疗药物、具备调节作用的RNA、转录因子和酶类等特殊蛋白质通过外源性药物改造方式，以外泌体包裹运输的形式，直达疾病标靶，从而解决新生儿给药普遍存在的吸收性低、生物清除率高、半衰期短的问题，提高疗效的同时减少不良反应。

3.2.2内源性物质 母乳的疾病防治作用主要取决于其成分组成，已有多项研究发现母乳中含有多糖，低聚糖，母乳多肽及分泌型IgA，乳脂球膜，乳清蛋白，乳铁蛋白，酪蛋白，胰岛素样生长因子-1、表皮生长因子在内的多种生物活性物质[43-45]。其中，母乳多糖可减少致病菌的黏附，保护早产儿肠上皮细胞免受细菌侵袭损伤[46]。而低聚糖对新生儿肠道菌群具有调节作用，有益于乳酸杆菌及双歧杆菌的生长，起到抑制病原微生物繁殖的作用[47]。母乳多肽则作为一类特殊的生物活性物，已经被证实具有抗感染、抗氧化、神经和免疫调控等功能[48]。

因此，凭借母乳多种内源性活性物质，借助外泌体自身优良的载药性，通过以上载药方法，合成外泌体-母乳独特内源性营养物复合体，能够较大限度地提高对母乳营养物质的利用。

4 小 结

母乳外泌体在母乳中含量较高，相较于其他体液更容易获取，且更易为人们所接受；同时具备低免疫原性的天然优势，作为高效、稳定、给药方便的载药复合体，是一个极具应用前景的研究方向。然而母乳外泌体改造后应用于临床仍然面临着巨大的挑战：①大规模生产高纯度的外泌体是目前外泌体应用于临床所面临的最大问题，目前的分离方法尚不成熟，大规模高纯度样本难以获取。②无论是对外泌体来源细胞进行加工还是对细胞分离提纯后的外泌体直接改造，两者均需在严苛的条件下进行，在此过程中外泌体本身的性能极易受到影响。③外泌体的生物学效应与来源细胞密切相关，制订出合适的筛选标准也是亟待解决的问题。因此，仍需谨慎对待这种新式载药体和改造手段，不断强化提纯技术和方案，制订安全的策略，进一步探索母乳外泌体在新生儿疾病中发挥的潜在生物学机制，使其尽快应用于临床。