精子激活在辅助生殖技术中的应用

单芳，胡蓉，王飞苗，吴昕

(宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川 750004)

精子激活是受精过程中的必要条件。哺乳动物的睾丸精子不运动，缺乏使卵子受精的能力[1]。精子在通过附睾的过程中获得动能，称为精子的附睾成熟，这是产生可育精子的绝对必要条件[2]。精子进入女性生殖道后过度活化，不能进行过度活化的活动精子仍不能受精[3]。受精是一个相当复杂的过程。卵母细胞通过触发精子的运动性、趋化性、结合性及顶体反应激活精子，最终融合两个质膜。精子对卵母细胞也有活化作用。精子与卵子结合，促使卵母细胞减数分裂的恢复，继而完成受精[4]。在人类辅助生殖技术(ART)中，部分男性不育患者夫妇可通过ICSI或ICSI联合卵子激活的方式成功受精，最终获得临床妊娠。但是，某些男性不育患者夫妇仍需借助精子激活改善妊娠结局[5]。

ICSI的引入，解决了部分男性不孕因素夫妇的生育问题，尤其是少弱精子症患者[6]。累积证据表明，用特定培养基稀释精子样本可以改善精子功能，提高精子活力[7]。最近的研究旨在通过使用精子激动剂(Spermagic)，结合精子处理程序，并在传统培养液中添加己酮可可碱、茶碱等改善少弱精子症患者的精子活力[8]。

一、精子激活概念

人工辅助精子激活即指对在临床实验室标准程序操作中出现运动活力低下的精子或无运动活性的精子通过应用化学激活剂、激光、精子激动剂等使其运动活性增强并提高精子运动质量[9]。生理情况下，在哺乳动物中，睾丸精子基本静止，不能使卵母细胞受精[10]。精子离开睾丸时会被一些大分子包裹。这些大分子在穿过附睾小管时逐渐消失，从而使精子获得运动能力，即精子“获能”，又称生理性精子激活[11]。此过程由相关离子浓度、pH值的逆转、及附睾小管中存在的无机和有机因素支持[12]。精子活力的维持还取决于钙的存在，并与环化腺苷酸(cAMP)含量的增加有关[13]。

二、精子激活机制

通常精子运动活力低下被归因于腺苷酸环化酶内源性刺激作用不足。该作用主要通过以下三个途径完成：①通过腺苷酸环化酶刺激cAMP的产生；②通过抑制环核苷酸磷酸二酯酶来减少cAMP的分解；③通过能由膜扩散的极性类似物来补充细胞内的cAMP水平。同时，cAMP可引起cAMP蛋白激酶的激活，继而使精子活动力增加[14]。目前，在少弱精子症患者中，精子质量与临床妊娠结局密切相关。这些患者通过手术获得精子数量较少，行ICSI很难找到活性精子，这会对后期胚胎发育和临床妊娠结局造成不利影响[15]。人工辅助精子激活可帮助这部分患者在ART过程中实现精子的优选，从而获得更好的临床妊娠结局。现综述以下几种人工辅助精子激活方式。

三、精子激活方式

(一)氦氖(He-Ne)激光

在人和动物细胞培养中，使用激光始终显示出调节和刺激细胞增殖的潜力。低强度氦氖(He-Ne)激光辐射可以生物刺激不同哺乳动物物种的精子运动。在冷冻精液储存过程中，它有助于长期保持精子活力[16]。He-Ne激光辐射提供的生物刺激，可以恢复冷冻保存的哺乳动物精子活力，对提高哺乳动物精子活力非常有效[17]。这是因为He-Ne激光照射可能在精子线粒体中诱导了电化学势的增强以及ATP合成的增强，在精子线粒体的能量产生和代谢中起关键作用[18-19]。这仅是一个推测，因为据报道精子的运动性依赖于Na+依赖性的Ca2+循环，He-Ne激光辐射可以通过作用于特定的激酶来改变细胞内Ca2+的浓度[17-18]。He-Ne激光对精子功能的显著影响取决于其波长，输出功率和持续时间等。一项动物研究表明，He-Ne光波长越短，照射持续时间越长，对精子活力的提高越明显[16]。目前，He-Ne激光在人精子活力提高方面应用较少。因此，临床缺乏标准化的激光治疗方案，特别是在刺激强度、频率和持续时间等方面。总之，He-Ne激光的临床应用有望提高男性生育率。值得肯定的是，与生物化学激活方式相比，激光更快，更安全，更容易，不需要事先治疗并且可以在ICSI期间进行。但是，由于其成本高昂，对于标准的IVF实验室来说，激光还不是必需的设备。

(二) 生物化学激活剂

1.非特异性磷酸二酯酶抑制剂类：己酮可可碱(Pentoxifylline，PTX)和茶碱属甲基黄嘌呤类似物，是3′5′-核苷酸酶甲基X稀基团的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，可通过防止其分解来提高细胞内环磷酸腺苷的水平[20]。

PTX是非特异性磷酸二酯酶抑制剂类别中研究最广泛的运动增强剂，主要用于提高活力较差精子的受精能力[21]。PTX可以提高cAMP的水平，cAMP增加会使精子产生更高的能量代谢活性，从而增强精子活力，启动获能过程。PTX也是一种抗氧化剂，可在体外保护精子免受DNA碎片的破坏[22]。PTX已成功地用于改善精索静脉曲张患者的精液参数。PTX改善精子活力的适用浓度为2.0～4.0 mmol/L，最佳浓度为4.0 mmol/L，最佳作用时间为1 h，此时精子活力最高，随时间继续延长，其作用效应逐渐下降[14]。但是，目前PTX对精子运动的调节作用尚有争议。有学者报告PTX对精子、卵母细胞及胚胎发育等会带来有害影响，可能会引起精子顶体反应过早发生，从而导致受精异常或受精障碍[23]。因此，由于PTX安全性尚不明确，临床应用仍需谨慎，可优先选择安全性较高的激光、生物素、SperMagic等。

茶碱具有与PTX相同的刺激作用。与PTX相比，茶碱在水中的溶解度较低，并且半衰期(生物利用度)更高，它会在几分钟之内诱导低运动活性的精子的运动，从而使活性精子的鉴定和分离过程变得更加容易[24]。这减少了胚胎学家进行显微操作所需的时间，也减少了卵母细胞暴露于室温下的时间，因此使用起来更方便。茶碱的应用将会改善卵子受精率，从而获得形态优异、生育潜能良好的胚胎。精子一旦暴露于茶碱衍生物，就会向前加速，侧头偏移增加和辉状跳动加剧，从而导致细胞能量消耗增加[25]。精子中高浓度cAMP能促进精子持续进行性运动，呈现超活化状态，但是精子运动时cAMP升高的机制尚不清楚，可能是因为磷酸二酯酶受到抑制所引起，也可能是除此以外的其它机制引起的精子胞内cAMP的升高。因此，精子暴露于茶碱后的持续进行性运动效应能否持续数小时仍需进一步证实。

2.生物素：生物素是一种B复合(B7)维生素，在生长发育中起着重要作用。计算机的靶标预测显示，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型(PTP1B)和葡萄糖激酶是生物素的可能靶标。溶液状态核磁共振(NMR)研究证实，生物素与人类肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)重组蛋白和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)相关联[21]。在精子洗涤培养基中添加生物素可以提高冻融后人类精子的活力和存活时间，同时改善受精潜力和植入前胚胎的发育[26]。生物素可以增强在体外条件下人类精子的活力和寿命，并且有助于精子保持较高频率的进行性运动和体外存活率，这可能与生物素治疗组中精子的细胞内cAMP水平升高有关[26-28]。生物素的最佳适用浓度范围为10～100 nmol/L，生物素在最高浓度100 nmol/L时，不会对胚胎发育产生明显有害影响，甚至可能会对植入前的胚胎发育产生有益作用[21]。为了安全起见，可从低浓度开始添加，其最佳剂量尚未探明。随着胚胎孵育时间的增加，适当剂量的生物素可使精子运动性增加，而随着孵育时间的继续增加，精子运动性逐渐下降。生物素为哺乳动物必需微量营养素，因此，它可能是比己酮可可碱更安全的精子活力增强剂[26-27]。目前，生物素安全性尚未探明。生物素可能会对精子DNA完整性及精子线粒体膜的完整性产生一定影响[25-26]，但是研究证据不足，尚需大样本研究证实，更广泛的临床应用仍需谨慎。

3.精子激动剂(SperMagic)：精子激动剂能够有效提高精子活力。多项研究发现，在新鲜精液或解冻精液中加入精子激动剂，可以促进钙离子内流并结合其受体，使精子获能，增强精子活力[29-33]。这有效缩短了精子注射和卵子体外操作时间，提高了受精率、2PN率、卵裂率和可利用胚胎率，从而间接提高临床妊娠率。王雪梅等[30]发现对重度少弱精子症患者行ICSI过程中加入3 μl精子激动剂可以提高精子活动力，并且对胚胎早期发育没有明显有害影响。另外，在夫精宫腔内人工授精助孕技术中，通过对处理后精液添加精子激动剂，可以明显改善精子活力[31]。Gu等[5]对96例睾丸穿刺取精(TESE)患者和106例绝对型弱精子症患者进行了研究，其中对47例TESE患者和68例绝对型弱精子症患者进行活动精子检测，并与对照组进行比较。另用精子激动剂培养基刺激49例TESE患者和34例绝对弱精子症患者的静止精子。结果显示，精子激动剂在受精、卵裂、植入、妊娠、活产和新生儿结局方面与对照组相比均无显著差异。因此，精子激动剂培养液不会增加不良新生儿结局的发生率，是ICSI过程中选择活性精子的可靠工具。国内外目前对于精子激动剂在临床上的应用报道较少，用于研究的样本数量远远不够，在大样本中对于胚胎发育参数的影响及其对子代远期影响尚不清楚，需要今后进一步的大样本统计分析。

四、结论

人工辅助精子激活方式多种多样。除以上介绍的几种精子激活方式以外，还有接触性刺激、咖啡因、左旋肉碱、三磷酸腺苷/硫酸镁(ATP/MgSO4)和2-脱氧腺苷等方式，但是临床应用较少。本文只说明了几种较常用精子激活方式。

国内外关于精子激活的报道多为小样本研究。关于精子激活周期妊娠和分娩的报道极其有限，精子激活对少弱畸精子症患者周期是否有效和安全性尚缺乏足够的证据。患者纳入条件和精子激活方法的不同，使得文献报道的数据难以汇总。目前，几种精子激活方法安全性都尚无有效证据证实，仍需今后临床大样本研究支持。因此，精子激活在以后的临床应用中需要严格把控其适应人群，建立有效临床适应指征。