干细胞移植治疗小儿脑瘫的现状和进展

易沙沙，罗凯旋综述，陈茉弦，敖丽娟审校

0 引 言

脑瘫是一种运动和姿势发育持续性障碍的综合征，这种综合征是由发育中胎儿或婴幼儿脑部的非进行性损伤引起的，脑瘫同时常伴有感知觉、认知、交流、行为障碍、癫痫以及继发性骨骼肌肉等问题[1]，需要广泛和多学科的管理。根据脑瘫的流行病学报道，每个国家的发病率都不一样，脑瘫全球平均的发病率大致为2‰[2]，而我国的发病率为2.48‰[3]，略高于全球平均发病率。新生儿重症监护和围产期护理技术的进步提高了新生儿的存活率，尤其是低出生体重和极低出生体重的新生儿的存活率[4]，同时随着二胎政策在中国的实施，许多家庭开始计划生育二胎，但是部分该女性的年龄超过35岁，而早产，孕母高龄是导致脑瘫的重要因素[5]，相关研究表明早产儿脑瘫的患病率呈指数增长，例如，与足月儿相比，孕33周之前出生的婴儿发生脑瘫的风险要高30倍[6]。这不仅增加了患者及其家庭的负担，对医疗卫生系统来说也是一个巨大的挑战。目前治疗脑瘫的方法有很多，如物理治疗、作业治疗、假肢矫形、药物干预、高压氧治疗、外科手术等，但是上述治疗方法几乎都是以改善患者活动和功能参与为目的，都不能完全治愈脑瘫。此外，尽管低温疗法可以明显降低围产期缺氧婴儿的病死率和减轻残疾，但是在接受低温治疗中，仍然有40%～50%的患儿死亡或者形成严重的神经功能障碍[6]。近年来，干细胞疗法作为多种新生儿疾病的治疗手段正在迅速发展，多项动物实验和临床研究表明干细胞移植治疗脑瘫是安全有效，这为脑瘫患儿及其家庭带来了新的曙光。

1 脑瘫的发病机制

任何影响胎儿或者新生儿脑部发育的因素都有可能导致脑瘫，这些因素大致分为以下3类[7]：①宫内因素：胎儿生长受限，胎盘血管疾病，宫内感染或者炎症，先天畸形；②围产期因素：早产，胎盘早剥，绒毛膜羊膜炎，新生儿窒息；③产后因素：脑室内出血，室周白质软化症、败血症和新生儿卒中。上述因素均可能导致健康脑组织不可逆转的损伤，影响儿童的脑部发育。其中，缺血或缺氧是引起新生儿脑损伤的常见原因，这一过程包括细胞能量耗竭、兴奋性中毒(即神经递质，特别是谷氨酸，过度兴奋引起的神经细胞损伤或者死亡)和氧化应激，氧化应激又会导致线粒体衰竭，进一步加剧能量的消耗，最终导致神经元和胶质细胞凋亡或坏死[8]。影像学研究显示，脑瘫的病变范围比较广泛，包括大脑皮层、半球白质、基底神经节和小脑。发生于不同脑部成熟阶段的损伤决定了病变的部位和类型，以及对损伤的反应。胎儿和早产儿大脑的血管扩张能力有限，增加了大脑缺血和弥漫性损伤的可能性，此外，早产儿的大脑室周白质深部是最脆弱的，与成熟相关的代谢和分子因素进一步加强了室周白质的易感性，因此，侧脑室附近白质坏死是早产引起的脑瘫的特征性病变[9]。相比之下，足月儿发生的损伤主要影响大脑皮层、皮层下深部和室周白质。

2 干细胞移植治疗脑瘫

神经细胞的损伤和细胞信号传导的中断会导致正在发育中的复杂的神经网络受损，而干细胞具有自我更新和分化成多种组织细胞的能力，可以在关键的神经发育窗口同时修复多个受损的神经成分，这种干预措施可能会给脑瘫患儿带来更好的疗效。

2.1干细胞的分类

2.1.1 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)MSCs是由多种类型细胞混合而成的骨髓基质细胞，具有造血和分化成多种功能细胞的能力，如脂肪细胞、成骨细胞、神经元细胞等，同时还能分泌细胞因子。骨髓被认为是MSCs的主要来源[10]，同时MSCs也存在于人类脐带血、Wharton胶(脐带血结缔组织)、脂肪组织和胎盘组织中，在其他组织中比较少[11]。已有研究证明骨髓来源的MSCs对局灶性脑缺血大鼠模型有神经保护作用[12]。有研究者认为Wharton胶来源的MSCs比骨髓来源的MSCs具有更低的分化程度和免疫原性，更高的增殖能力，更强的旁分泌能力[13]，因此更有可能分化为神经细胞修复大脑受损区域。但是有其他研究者对MSCs在神经发生的分化潜能尚有争议[14]，因此还需要进一步探索其作用机制。

2.1.2胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)ESCs可以从早期胚胎或原始腺中分离，并且能够被诱导分化为机体内几乎所有的细胞，通过特定的培养方法，ESCs也可以转化为神经元[15]。在动物实验中发现将体外分化为神经元的ESCs移植到脑瘫大鼠体内可以改善实验动物的空间记忆[16]。但是，ESCs是目前最有争议的干细胞。一方面，ESCs的增殖能力及其分化成多种细胞类型的潜力有可能会引发肿瘤[6]，另一方面， ESCs的获取通常需要破坏胚胎，其应用仍然存在长期的伦理道德问题。

2.1.3神经干细胞(neural stem cells，NSCs)NSCs存在于成年哺乳动物的嗅球、海马和腹侧纹状体等区域[17]，也可以从胚胎或者胎儿脑组织中提取。NSCs不仅可以通过分泌神经营养因子、生长因子和细胞因子等来改善患儿大脑损伤区域的微环境，促进损伤的修复，此外，在一定条件下，NSCs还可以分化成星型胶质细胞、少突胶质细胞和神经元,发挥神经保护和细胞替换的作用[18]。

2.1.4脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cells，UCBCs)脐带血中含有大量的原始多能干细胞、祖细胞，内皮前体细胞，和具有治疗潜力的非造血细胞，有修复受损组织的潜力，是干细胞的主要来源之一，非常适合用于细胞治疗[19]，已经在各种神经系统疾病的治疗中显示出巨大的潜力。尽管相对于其他干细胞来说，UCBCs具有较少的伦理问题，更容易收集，并且能够耐受更多的人类白细胞抗原而减少排斥反应，用于治疗时更有效安全，但是每个婴儿获得的UCBCs的数量和每个批次内的干细胞数量都是不同的和不均匀的，而且UCBCs的收集量与胎龄成正比[20]，因此，早产儿可能不是自体干细胞移植的最佳候选者。

2.1.5诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)IPSCs在表型、端粒酶活性和分化能力等方面与ESCs非常相似，被认为是胚胎干细胞的最佳替代品。而且IPSCs可以利用患者自身的细胞制备，不会产生免疫排斥的问题[21]。但是未分化的IPSCs的增殖和分化不受控制[22]，以及其基因组的不稳定性[23]，可能会导致肿瘤的产生。其致瘤性、有效性和安全性都还需要进一步的实验研究。

2.1.6少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)OPCs来源于胎儿脑组织，或者通过ESCs或IPSCs分化而来。有研究发现，ESCs来源的OPCs可以改善脊髓损伤大鼠的功能障碍[24]。国外研究者发现，OPCs可以通过阻止脑室周围白质的神经元脱髓鞘，恢复室周白质软化动物的神经行为障碍和认知缺陷[25]。

2.1.7多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPCs)MAPCs是未成熟的细胞群，在体外可以分化为间充质细胞和具有内脏中胚层、神经外胚层与内胚层特征的细胞。MAPCs存在于人体的所有组织中，负责维持体内稳态和组织的修复[26]。有研究表明，在新生缺血缺氧的大鼠模型中使用MAPCs能够保护神经元和改善大鼠的行为学结果，治疗作用至少持续了6个月，其可能是通过营养机制而不是细胞替代发挥作用[11]。

2.2作用机制干细胞具有多能性，并且能够对微环境信号作出反应，从而指导细胞分化和活动[27]。虽然干细胞移植治疗脑瘫的作用机制还不完全清楚，但是移植的干细胞已经被证明能够取代神经元，胶质细胞和血管细胞，并且释放营养因子[28]。最初认为干细胞移植治疗脑瘫的关键机制是细胞分化后的替代作用，但是最近有研究表明移植的干细胞介导脑瘫患者功能恢复的主要作用来自于旁分泌效应对中枢神经系统微环境的影响，而不是直接的细胞替换[29-30]。旁分泌的一些细胞因子如粒细胞集落刺激因子、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、肿瘤坏死因子α，IL-10，前列腺素E2等在免疫调节，髓鞘的形成以及神经前体细胞的存活、增殖与分化等方面发挥了重要的作用[31]，同时还能促进NSCs的迁移和增殖[32]。值得注意的是，干细胞移植治疗脑瘫的作用会因为干细胞的来源和给药时间的不同而有所差异。在干细胞移植早期，大脑微环境的恢复可能是驱动损伤修复的原因，同时移植的干细胞对免疫调节，细胞黏附分子(如整合素，钙粘蛋白)和细胞代谢也有明显的影响[33]。移植数周后，旁分泌作用可能最为明显，干细胞分泌的生长因子和神经调节因子会直接影响小胶质细胞的表型，另外干细胞长期的效应可能会影响神经细胞的存活，从而影响细胞内的相互作用、神经环路的建立以及轴突的髓鞘化[34]。此外，干细胞还分泌含有miRNA，蛋白质，受体等多种可以促进损伤大脑发育的细胞外囊泡，如外泌体[35]。外泌体很容易穿过血脑屏障[36]，并且可以通过炎症驱动机制积聚于损伤区域，调节免疫信号的传导，促进血管生成[38-39]，同时还能影响转录和翻译后修饰。有研究已经证明MSCs分泌的外泌体能够改善大鼠出生后炎症性脑损伤的认知和运动功能[39]。细胞外囊泡的机制可能为“无细胞治疗”开辟了新的方向，体内和体外的实验都表明通过获取干细胞分泌的细胞外囊泡来干预疾病的“无细胞治疗”方法与干细胞治疗可以达到同样的效果，同时还能避免伦理道德和一些安全性问题[40]。但是外泌体的具体作用机制还需要进一步研究，“无细胞治疗”的开展也还需要大量的实验来证明其安全性和有效性。

2.3干细胞的最佳移植途径、剂量和时机确定最佳移植途径对临床上干细胞移植治疗脑瘫至关重要。因为移植途径会直接影响干细胞到达损伤部位的有效剂量。目前，可以通过脑室，鞘内，鼻腔，肌肉和血管移植干细胞。通过血管的移植途径可以调节炎症反应，但是由于干细胞无法穿过血脑屏障，可能会停留在非损伤区域，甚至有肺栓塞的风险，所以该移植途径可能不是治疗脑瘫的最佳选择[41]。同样的，肌肉内注射干细胞到达中枢神经系统的细胞剂量也会比较少。因此，直接将干细胞输送至中枢神经系统损伤区域才能最大限度发挥其作用。借助腰穿的鞘内移植尽管创伤较小，脑脊液可以将干细胞运送至损伤部位，但是反复的穿刺和注射会增加患者感染的机会和痛苦。尽管经脑室的局部注射能够提高药效，但是也不适用于相对比较脆弱新生儿。相比之下，鼻内注射可能更适用于新生儿[42]。所以，不同的脑瘫患者移植干细胞的途径也有所不同。有研究者对干细胞移植剂量和时机进行了探索，Drobyshevsky等[43]将人UCBCs移植入脑瘫兔模型中发现大剂量的UCBCs比一半大剂量的UCBCs更能显著改善动物的运动姿势，肌力和肌张力障碍，此外他们通过MRI生物标记物或者PCR还发现在新生儿期注入的UCBCs几乎没有穿过大脑，这也证明了干细胞是通过旁分泌作用而不是直接的细胞整合或增殖效应发挥治疗作用。但是，其不同剂量的实验并不是同时进行的，没有直接的对比，而且大剂量的概念也没有统一标准，所以干细胞剂量是否与疗效成正比还需要进一步的研究。McDonald等[44]认为出生后4h可能是临床上干细胞移植的一个关键的时间点，尽管越早干预疗效会越好，但是移植的确切时间还取决于诊断脑瘫的时间，获得家属同意所需的时间以及临床试验的结果。

2.4临床研究干细胞移植治疗脑瘫的方法已经在多种脑瘫动物模型中进行了实验，其令人鼓舞的临床前研究结果为干细胞治疗脑瘫的临床转化带来了希望。研究者已经开始进行干细胞移植治疗脑瘫患者的临床试验。在Nguyen等[45]进行的一个非对照的临床研究中，40名脑瘫患者接受了自体骨髓单核细胞的移植后，他们的运动功能和肌张力都比治疗前有了明显的改善，在接受治疗后没有用明显的副作用和不适反应，该研究表明细胞疗法对于缺氧引起的脑瘫是安全有效的。但是该临床试验随访时间较短，脑瘫患者接受治疗后的长期效果不明，同时也应该进一步进行双盲的临床对照试验对疗效进行评估和监测。在Jessica等[46]的二期临床试验中，他们证明了脑瘫患儿自体脐带血的输注可以改善患者的运动功能，通过MRI发现患儿大脑的感觉运动网络连通性增加，且这种连通性与输注剂量有关。但是考虑到多数患儿家庭可能没有保留脐带血，所以需要进一步研究异基因脐带血治疗脑瘫患者的安全性和有效性。鉴于脐带血比较容易收集，且含有大量的原始多能干细胞和MSCs，所以国内的临床研究多集中于脐带血来源的干细胞治疗脑瘫。Huang等[47]证明了输注人脐带血来源的MSCs联合基础康复治疗对改善脑瘫患儿的总体运动能力和综合功能是安全有效的，而且在治疗后的第3、6、12、24个月随访中通过脑电图的结果证明了脑功能有所改善，但是常规MRI并未发现患儿大脑结构的改变等，研究者认为可能与MRI的灵敏度有关。这也提示我们，细胞疗法和其他康复技术结合可能会达到更好的治疗效果。除了联合其他治疗方法，还存在许多因素影响干细胞的疗效。Wang等[48]通过腰穿的方式移植脐带血来源的MSCs治疗8对同卵双生的痉挛型脑瘫患儿，发现具有相同遗传学背景的同卵双胞胎脑瘫患儿对干细胞移植治疗的反应具有高度的一致性，而不同遗传学背景的脑瘫患儿对干细胞治疗的反应则存在显著性差异，这表明不同的治疗效果与遗传背景有关，遗传因素可能会影响干细胞的作用机制。另外有研究者比较了骨髓MSCs、骨髓单核细胞和常规的康复治疗对痉挛型脑瘫患儿的疗效，他们发现与常规的康复治疗相比，骨髓MSCs和骨髓单核细胞都能够明显改善脑瘫患儿的粗大运动和精细运动功能，但是骨髓MSCs有益作用更加显著，持续时间更长，同时整个治疗过程无明显的不良反应[49]。国内其他研究者采用自体骨髓MSCs转化NSCs移植治疗52名脑瘫患儿，在接受治疗后的第1个月、第6个月、第18个月后通过粗大运动功能评定(GMFM-66和GMFM-88)评估总体运动功能，发现移植干细胞后，患儿的GMFM评分明显改善，并且研究者比较了不同移植方式(颅内移植和腰椎穿刺)、患儿年龄和性别对疗效的影响，均未发现有显著性差异。但是在比较移植方式时，并没有很好的限定患儿年龄，所以移植方式对疗效的影响还需更加完善的实验加以证明[50]。综上，目前仍然缺少大规模的临床试验为干细胞治疗脑瘫提供强有力的证据以促进其临床转化。其他干细胞，如NSCs、ESCs，可能由于伦理问题和致瘤性等安全性问题，临床试验开展得较少，主要还是集中在动物实验中。

2.5辅助干细胞移植治疗脑瘫的方法移植的干细胞能够集中于损伤部位将在很大程度上提高疗效。除了改进移植途径以外，还可以通过其他辅助方法来实现这一目的。有研究发现，炎症因子、集落刺激因子、趋化因子和营养生长因子等细胞因子不仅可以促进移植的干细胞向损伤区域迁移[51]，而且可以增强干细胞的旁分泌效应[52]。因此，干细胞移植联合这些细胞因子治疗脑瘫可以进一步提升疗效[53]。随之产生的转运载体也引起了大众的关注。最近，Lin等[54]构建了一个多元的聚氰基炳烯酸丁酯纳米粒子，该纳米粒子表面吸附或封装的BDNF不仅可以诱导IPSCs的分化，促进损伤区域神经元轴突和树突的生长，从而更好的发挥干细胞的治疗作用，而且还能作为IPSCs的一个追踪剂，可以对移植的干细胞进行监测。另外，随着组织工程技术的迅速发展，生物可降解材料逐渐用于疾病的治疗，为干细胞的移植带来了新的前景。生物可降解材料联合干细胞已经被证明可以用于脊髓损伤的治疗[55]。在缺血缺氧性脑损伤的脑瘫患者中，脑部可能会由于组织大量坏死而形成坏死腔,由于缺少血供和足够的细胞外基质，该区域的微环境受损，不利于移植的干细胞发挥作用。Shin等[56]通过将人神经前体细胞与生物材料聚合物支架结合的复合物移植入脑瘫小鼠模型的脑部坏死腔中，发现该复合物不仅能够诱导移植干细胞的存活和分化，而且还能减少坏死面积，改变双侧大脑半球神经元与其靶细胞之间的连接。移植干细胞与转运载体相结合的优化多学科的方法将为脑瘫的治疗提供一种新的思路。

此外，有研究者发现氧气浓度会在一定程度上会影响干细胞的治疗作用。Zhao等[57]发现1%的低氧浓度比正常氧气条件下能更好地维持干细胞的性状，在1%的氧气浓度中，干细胞具有更大的增殖潜能[58]，这可能与干细胞在低氧环境中分泌更多的血管内皮生长因子和更少的IL-6，同时激活相关干细胞信号通路有关[56]。因此氧气浓度可能是干细胞移植治疗脑瘫的一种重要的辅助途径。

3 结语与展望

随着对脑瘫的深入研究，各种治疗方法不断涌现，但是多数方法只能延缓疾病的进展，至今还没有能够治愈脑瘫的方法。考虑到脑瘫患者随着年龄的增长，功能需求会有所变化，同时鉴于脑瘫患者受损的中枢神经具有一定的可塑性，所以应该着重关注治疗方法的安全性和有效性。随着临床前研究到临床试验的结果表明，干细胞移植治疗脑瘫有着巨大的潜力，但是在细胞治疗方面，仍然有许多挑战，如干细胞的来源，制备，移植途径，移植剂量和移植时机都对疗效有着深远的影响，以上相关参数还需要进一步探索以制定严谨的治疗方案。而且尽管干细胞移植后较少产生严重的不良反应，但是出现的一些并发症，如畏寒，发烧，过敏性休克，排斥反应等，也不容忽视。此外，还需要继续研究脑瘫的发病机制和干细胞移植驱动损伤恢复的作用机制，为细胞疗法提供更多的证据和科学的支持，从而促进干细胞治疗脑瘫的临床转化。