三维打印技术在骨组织工程中的应用进展

张鑫,王新涛

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨科，哈尔滨 150081)

近年来，由于创伤、感染、肿瘤等原因导致大面积骨缺损的患者越来越多，故如何治疗骨缺损成为骨科医师有待解决的问题。Hayrapetyan等[1]发现，骨组织在一定范围内具有很强的再生能力。当前骨缺损的治疗主要依靠自体、同种异体和异种骨移植等，但均未取得良好效果。骨组织工程学由Grane等[2]于1995年提出。骨组织工程学是将支架与细胞和细胞因子复合，随后将构建好的骨组织工程支架移植到骨缺损区域，以新生骨组织替代支架材料，从而修复骨缺损[3]，其包括支架载体、种子细胞和细胞因子3个基本要素。其中支架作为一种临时的、人工的细胞外基质，能够促进新骨形成[4]，对细胞的增殖和分化有直接影响[5]。理想的骨组织工程支架应具备适宜的孔隙率及表面积比、较好的生物相容性、表面活性及与临床应用匹配的外形，并能够促进细胞黏附及血管、神经的生长[6-7]。骨组织支架材料包括生物陶瓷、天然生物材料、人工合成材料等。应用常规技术制备的骨组织工程支架仍存在许多缺点，如支架无法个体化制备，无法控制支架孔隙率、孔径大小、孔隙之间的连通率，且细胞在支架载体上的黏附率低[8]。经过不断的尝试，研究者最终将三维打印技术应用到骨组织工程中，制备出了理想的骨组织工程支架。现对三维打印技术在骨组织工程中的应用进展予以综述。

1 三维打印技术

三维打印技术也称增材制造，是根据CT、磁共振成像等数据重建模型或计算机辅助设计的数据，通过将材料精确的分层堆积，快速打印出与骨缺损区域几乎完全相同的三维多孔高活性骨修复支架[9]。该技术由美国学者在20世纪90年代研制成功，其机制是以能够固化的材料分层叠加的方式实现快速成型的技术[10]。

三维打印技术具有准确度高、快速及可定制等优点，其越来越广泛地应用于生物医学领域。在影像学和数字化医学的帮助下，医师可以利用三维打印技术打印所需要的特定模型，从而获得更加全面的信息。临床医师可以通过模型进行模拟性手术，从而制订更全面、更优化的手术方案，缩短手术时间，提高成功率，减少术后并发症发生[11-12]。Xu等[13]以三维图像数据为基础，使用三维打印方法成功制备了枢椎椎体，同时成功进行了三维打印人工椎体置换、颈椎椎体全切脊柱重建术，术后患者恢复良好。在医学中，最常用的技术为熔融沉积建模(fused deposition modeling，FDM)、选择性激光烧结(selective laser sintering，SLS)和立体光刻(stereolithography，SLA)[14]。

1.1FDM FDM是一种以挤出为基础的技术，其是将热塑性塑料或复合长丝加热到半熔融状态，然后通过计算机控制的喷嘴挤出。目前，关于FDM的优点和局限性仍存在争议。Liu等[15]报道，FDM技术可以利用医用级丁腈苯乙构建坚固的骨模型、植入物，丁腈苯乙是一种可以在手术前进行适当消毒的材料。但Garg和Mehta[14]报道，虽然FDM比SLS和SLA速度更快、价格更低，但该技术的准确性较低，而且由于所用材料的熔点低，在手术前消毒方面存在一定困难。因此，建议仅在术前使用FDM。目前，还不能确定FDM是否可以在术中使用。

1.2SLA SLA是一种基于还原聚合的印刷，当激光束射入光固化液体树脂后，树脂逐层固化-从液体转向固体聚合物(称为光聚合)-直到三维结构打印完成。SLA是第一个获得专利的三维打印技术，广泛应用于各个医疗领域。个性化设计、大规模定制、利用最大化和制造复杂结构的能力是SLA作为一种制造技术的主要优势。SLA打印机可以生产出表面光滑的物体，但是光致聚合物建筑材料相对昂贵。Li等[16]采用间接SLA法制备了微孔β磷酸三钙，并采用该工艺制备了树脂模具，填充了热固性陶瓷水基悬浮液，用于陶瓷凝胶浇注。采用热处理工艺去除树脂模具。结果表明，烧结后的β磷酸三钙材料具有理想的孔隙率、形状和较高的强度。也有研究通过紫外光激光以分层方式光固化液体树脂来制备3D物体[17-18]。SLA的主要优点为制备出的3D物体具有更好的表面光洁度和更高的精度[19]。

1.3SLS 在SLS中，高能激光束产生局部热源，该热源将粉末材料部分熔化并融合成所需的图案。热源一次熔合一层，直到生成三维结构。在SLS中，金属合金和陶瓷是使用最多的材料。SLS技术具有很高的精度，可以打印小至(0.5±0.2) mm的三维模型[15]。然而，Liaw和Guvendiren[20]指出，由于粉末材料处于半熔融状态，故SLS的最终产品具有粗糙、研磨的表面和多孔的内部结构。因此，SLS打印通常需要更多的后处理。Hoffmann等[21]采用SLS技术制备镍钛合金多孔支架，然后将打印好的支架与间充质干细胞在体外共同培养，发现间充质干细胞可以沿着成骨谱系增殖、分化，具有良好的生物活性，能够缩短患者恢复期。

2 三维打印技术与骨组织工程

三维打印技术通过影像学收集骨缺损的数据，借助计算机的辅助，设计出较为理想的三维立体结构，再选用理想的材料，制备出合适的骨组织工程支架。与传统方法相比，三维打印技术具有以下优势：全自动化，操作简便、打印速度快，可以重复打印；无需特殊工具，能够根据患者实际情况进行个体化制备；能够打印出具有理想的孔隙率和孔径的支架；多种细胞、细胞因子以及基因均能够同步打印到支架的指定部位[22-23]。

2.1三维打印生物材料 近年来，骨组织工程及再生医学不断进步,三维打印技术在开发和制造由仿生天然和合成材料组成的仿生支架方面应用更加广泛。骨组织工程中的打印材料需具有一定的机械性能、骨诱导性及骨传导性，同时具备良好的生物降解性，一般可分人工合成多聚体类、生物陶瓷、天然高分子聚合物等。

2.1.1人工合成多聚体类 以聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物为代表的人工合成多聚体，具有良好的生物相容性，无毒的降解产物，可通过体内代谢排出，但这些材料在亲水性及机械强度等方面存在不足[7]。较早的组织工程支架大多经纺织技术将聚羟基乙酸等材料的纤维制造成骨架。由于该支架结构稳定性差，力学性能不足，不能用于硬组织培养。而Pati等[24]应用多个喷头打印出聚己内酯/聚乳酸/β磷酸三钙复合生物材料支架，并将骨髓间充质干细胞与支架复合培养，将干细胞分泌的细胞外基质附着于支架上，然后保留细胞外基质并去除干细胞，制备出聚己内酯/聚乳酸/β磷酸三钙/细胞外基质支架，该支架既可以达到生物力学要求，又可以加速生物矿化过程。Xu等[25]通过热致相分离与三维打印技术制造了聚乳酸-羟基乙酸共聚物/天然珍珠的复合三维支架，该支架具有较高的孔隙率、合适的孔径和一定机械性能，将其与骨髓干细胞进行复合培养，干细胞能够进行良好的增殖与分化，证明其具有生物相容性和骨诱导性，能达到骨组织工程中支架的要求。

2.1.2生物陶瓷 磷酸钙盐陶瓷是骨组织工程支架应用最多的材料，其中羟基磷灰石和磷酸三钙最具代表性。羟基磷灰石有良好的骨传导性、骨诱导性、生物相容性、无细胞毒性等优点，同时其还能刺激成骨生长因子(如骨形态发生蛋白)的内源性表达，并增强间充质干细胞中碱性磷酸酶的活性，但其也有脆性大、不易塑型和不易降解等不足[26-28]。Adel-Khattab等[29]以含有钙磷酸钙的二氧化硅为材料，以Schwartzwalder Somers方法和3D打印技术制备支架，在体外检测了支架的机械性能和物理性质(孔隙率、压缩强度、溶解度)，同时将两种方法制备的支架与鼠成骨细胞(MT3T3-E1)共同培养7 d发现，Schwartzwalder Somers方法制备的支架总孔隙率(86.9%)明显高于3D打印技术制备的支架(50%)，但3D打印技术制备的支架内部微孔结构更多，拥有更高的抗压强度和二氧化硅释放功能，表明3D打印技术制备的支架具有良好的机械和生物学特性。Roohani-Esfahani等[30]采用三维打印的方法制备了具有六方孔结构的微晶玻璃支架。与具有相同孔隙率的陶瓷-玻璃支架相比，其所制造的支架具有150倍的强度，表明这些支架具有优异的承载和节段性骨缺损治疗能力。

2.1.3天然高分子聚合物 天然高分子聚合物，也称为生物衍生材料，存在于自然界中，可以通过物理或化学方法提取。这些聚合物已广泛应用于许多工业领域，如食品、纺织品、纸张、木材、黏合剂。天然高分子聚合物包括胶原、藻酸盐、淀粉等，它们具有良好的生物相容性及细胞识别信号，能够促进细胞的增殖、黏附及分化。天然高分子聚合物、具有良好的水溶性，且容易与黏结剂结合，可以广泛用于3D生物技术打印的组织工程支架。但它们难以大量获取，降解时难以控制，缺乏一定的机械强度，不足以作为理想的支架载体，但可作为良好的添加剂[31]。近年来有学者将其应用于骨组织工程中，Yu等[32]以纳米羟基磷灰石和聚(酯脲)为材料，通过熔融沉积模型打印出孔隙率为75%的三维多孔支架，随后将MC3T3-E1细胞与该支架复体外复合培养，发现在羟基磷灰石含量高的支架中，通过提高碱性磷酸酶活性、增加成骨细胞基因和蛋白的表达以及促进矿化，细胞能够长期处于高分化状态，羟基磷灰石表面能够赋予支架骨诱导性和骨传导性，使该支架在骨组织工程方面优于其他聚合物支架。Ren等[33]通过生物打印Ⅱ型胶原水凝胶构建具有梯度软骨细胞密度的工程化带状软骨，Ⅱ型胶原具有维持软骨细胞表型的能力，并在促进软骨细胞分化方面发挥重要作用。3D打印的带状软骨具有梯度细胞外基质分布，其与软骨细胞密度呈正相关。

2.2三维打印细胞和细胞因子 现有制备组织工程骨的方法大多是在支架上接种细胞，细胞与支架在体外共同培养，培养一段时间后，移植到患者体内，随着细胞的增殖、分化以及支架的降解，最后以新生骨组织替代支架材料。但此种方法只是将细胞与支架整合到一起，没有达到预期的效果[34]。三维打印技术可将细胞接种在支架的指定位置，还可以将细胞因子添加到支架中，促进细胞的增殖和黏附，这样能够同步控制打印支架材料、细胞和细胞因子[35]。

细胞是骨组织工程的三大要素之一，其用于三维打印主要考虑以下几个因素:①能够在体外大量培养；②支架中的细胞还具有增殖和分化能力；③打印后的细胞具有活性；④细胞类型不同且之间存在差异；⑤多种细胞共同参与组织发育和信号转导[36-39]。随着三维打印技术的不断成熟，细胞打印也取得了一定的进展。Li等[40]应用三维打印技术，以羟丙基甲壳素为生物墨水，成功打印人类诱导多功能干细胞，培养10 d后发现打印出的细胞存活率>90%且表现出较高的增殖效率。与静态悬浮培养相比，在三维印刷结构中形成的人类诱导多功能干细胞团表现出更高的均匀性。采用新的双荧光标记方法，发现构建物中的人类诱导多功能干细胞聚集物更倾向于原位增殖而不是多细胞聚集。同时发现三维打印的细胞具有产量高、聚集性均匀等特点。Cui等[41]将活的软骨细胞与聚乙二醇二甲基丙烯酸酯混合，成功制造出能够打印的生物墨水，同时结合紫外光，制备出水凝胶修复支架。结果表明，软骨细胞在水凝胶软骨支架中呈现均匀分布，且直接紫外光照射打印的支架细胞的存活率较先沉积后光照聚合打印的支架细胞高26%。Gao等[42]通过喷墨打印技术，将悬浮聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中的人骨髓间充质干细胞、生物活性玻璃和羟基磷灰石的纳米颗粒3种混合的物质共同打印，成功制备支架。与单纯聚乙二醇二甲基丙烯酸酯支架相比，该复合支架上的细胞能够精确到达目标位置，细胞存活率达(86.62±6.02)%，支架中的羟基磷灰石对人骨髓间充质干细胞的成骨分化和成骨细胞外基质的产生有显著的促进作用，该支架细胞毒性最小。

细胞因子有促进细胞增殖和分化等作用。有研究将打印好的支架与生物活性因子相复合，再植入到动物体内进行骨缺损的修复[43]。且利用三维打印同步装配细胞因子具有很多优点，它能够准确地构建接近人体内微环境的复杂三维结构。Ritz等[44]以聚乳酸为材料，采用三维打印技术打印出形状为多孔笼状的支架载体，并在笼中添加基质细胞衍生因子1，该支架较单纯的聚乳酸支架的内毒素污染低，机械稳定性较好，同时利于内皮细胞的生长及诱导新生血管形成。Cooper等[45]采用喷墨印刷技术进行支架打印，通过喷墨浓度来调节生长因子在支架个别位置上的浓度；不需要定制模板来创建特定的模式，实验周转时间相对较快；喷墨打印的分辨率足以产生较快的细胞生物反应。

3 问题与展望

三维打印是一种新型数字化成型技术，它的出现为骨缺损的修复提供了一种全新的方法，但目前三维打印技术还存在许多缺点和不足：①在医学领域三维打印技术的打印、所需材料及设备费用较高，这导致其不能进行大批量打印，从而限制了临床应用。②对于骨组织，单纯的水凝胶、胶原打印的支架载体机械性能及生物性能无法达到支架要求，虽然当前能够通过共印热塑性聚合物来增加机械强度，但是部分无机材料在不进行高温烧结的情况下并不能取得所需的生物力学效果[46]，目前植入物是否有机械强度仍存在争议。③三维组织/器官打印技术的目的均是重塑复杂器官的微观结构，该过程不仅耗时长,且对细胞数量要求巨大，细胞经过长时间打印，其存活率降低的同时，打印体的生物功能也可能会发生变化。这些缺陷和不足是推动三维打印技术的动力，只有消除存在的缺点，三维打印技术才能更快的发展。相信未来三维打印技术在骨组织工程领域中将会更广泛的应用。