骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松性骨折的机制

杨显红，齐新文，李松军

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院骨二科，广东 珠海 519100)

骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是骨组织发生实质结构疏松、骨脆性增加等病理生理改变后，在低能量甚至无暴力情况下发生的一种病理性骨折，以高发病率(13%)、高致残率、高致死率的特征严重危害人类健康，成为继心血管疾病、糖尿病之后的第三大慢性疾病[1]。流行病学调查显示，我国部分地区OPF患病率高达55.8%，成为全球OPF发病率最高的国家，是老年患者致残和致死的主要病因[2-4]。目前临床上治疗OPF主要以手术内固定为主，但骨实质结构疏松易导致骨折延迟愈合，甚至不愈合，显著增加了再骨折的发生风险[5]。因此，寻找有效的治疗方向和措施对OPF有重要的研究意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于机体结缔组织和间质中具有多向分化潜能的一种干细胞，BMSCs数量减少或生物学活性下降可减弱成骨细胞的增殖能力，使骨小梁生成减少，引起骨组织动态重建失衡，骨实质微结构稀疏，最终发生OPF[6]。另一方面，在OPF发生时，BMSCs可通过细胞分泌、免疫调节、基因调节、信号通路等多种作用机制促进受损骨组织生成新骨，同时还可提高局部血管的再生能力，为骨组织重建提供良好的微环境。可见，维持BMSCs的正常生物学活性与OPF的疾病治疗之间有着密切的联系。现就BMSCs治疗OPF的机制予以综述。

1 BMSCs概述

BMSCs于轴骨或外周骨松质骨(海绵状)的骨小梁中生成，在体内、体外多种不同的诱导条件下可进一步分化为胰腺细胞(内胚层)、成骨细胞和软骨细胞(中胚层的)以及神经细胞(外胚层)等多胚层细胞，与机体多系统功能的维持有重要的联系。研究显示，BMSCs在骨髓组织中表达最丰富，但含量很少，且与年龄的增长呈负相关；同时，体外实验研究证实，可通过控制细胞的培养条件，致使BMSCs作为“种子细胞”被定向诱导分化为特定的功能目的细胞，到达特定部位，完成归巢，从而发挥特有的生物学活性作用；且BMSCs可多途径获得，具有标本取材方便、体外增殖能力强、细胞顺应性高、免疫排斥反应弱等优点，经局部微环境移植到宿主后对激素性、糖尿病性、代谢性、老年性等多种OPF均有一定的疗效[7-8]。近年来，BMSCs的移植治疗机制、途径、剂量等成为骨折治疗的研究热点。

2 BMSCs治疗OPF的相关机制

2.1BMSCs归巢 BMSCs归巢是OPF治疗机制的重要环节，OPF发生时，BMSCs在机体各种机制的协同作用下进入血液循环，与受损骨组织中被激活的血管内皮细胞进行高速“滚动”接触，并且在局部炎症因子、免疫调节因子、趋化因子等多细胞因子刺激下发生卷曲形变，随即粘连附着在血管内皮细胞上，与G蛋白偶联因子、整合素等跨膜受体相结合激活后，可穿跨细胞膜，进入骨髓龛位微环境；紧接着，在白细胞介素-1、炎症趋化因子、转化生长因子-β等各种细胞因子的介导下，与骨折处血管内皮细胞上的“地址素细胞黏附分子”靶向结合，发生定向迁移和分化，最终实现BMSCs到达OPF病变部位，从而发挥生物学活性的归巢和植入过程；由此可见，在血管内皮细胞上的滚动过程是BMSCs归巢的第一步，研究BMSCs归巢机制有十分重要的意义[9-10]。

但是BMSCs自身缺乏血管内皮细胞的紧密结合能力，移植到动物体内骨折处5～8 d后，在骨折区才有微弱的荧光信号，代表了少数BMSCs完成归巢移植过程，且该信号持续1～3 d后消失[11]。因此，提高BMSCs移植归巢率对治疗OPF有十分重要的作用。BMSCs表面能够表达多种整合素分子，可促进BMSCs的附着归巢过程。试验显示，在P-选择素基因缺失或体内呈现中和抗体的P-选择素元件时，人BMSCs与人脐带静脉内皮细胞滚动结合的发生率会显著降低[12-13]。另外，Xiao和Chen[14]研究发现，表达含有N-连接唾液乳糖胺的CD44糖原变异体使用α-(1，3)-岩藻糖基转移酶vi修饰后，产生E-/L-选择素配体，诱导兔BMSCs岩藻糖基化，在注射BMSCs移植6周后检查发现，小鼠的归巢能力显著增强。侯费祎等[15]将4′,6-二脒基-2-苯基吲哚标记的BMSCs静脉注射于颅骨缺损的大鼠体内，同时予麝香酮灌胃干预后发现，麝香酮可显著增加骨组织缺损处的BMSCs数量，并呈浓度依赖性，提示麝香酮可促进BMSCs在大鼠体内的归巢。由此表明，增加特定选择素、整合素等基因和蛋白的表达，降低体内相关抗体蛋白的分泌或进行必要的蛋白“修饰”细胞后，可能会有效提高BMSCs与血管内皮细胞的结合率和归巢率。越来越多的研究人员试图用基因转染修饰工程来解决这些问题。Wang等[16]研究发现，红色荧光蛋白转染的BMSCs更容易定位于骨折部位，且股骨的力学性能得到显著改善。

2.2细胞分泌 细胞因子在细胞增殖、分化、胚胎发育、细胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着不可或缺的作用。BMSCs完成滚动接触、附着、迁移和分化等过程需要一个可以保持自我更新和多向分化潜能的良好微环境。在特定微环境下，BMSCs自身可以表达很多细胞因子，并促进一系列细胞因子释放，通过自分泌及旁分泌的途径促进成骨细胞不断增殖分化。Lu 等[17]发现，肿瘤坏死因子-α增强核因子、胞外信号调节激酶活化后，呈剂量依赖性地提高血管细胞黏附分子1的表达水平，促进人脐带BMSCs紧密黏附于静脉内皮细胞。而转化生长因子和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在成骨及成软骨方面起着重要作用，常晓朋等[18]研究显示，经慢病毒包装的重组质粒转染后的BMSCs、BMP-2及转化生长因子-β2的表达水平显著升高。同时，在微环境的形成过程中，还有其他细胞因子的参与。于佳等[19]研究表明，在卵巢早衰模型大鼠体内注射BMSCs后15 d，大鼠体内胰岛素样生长因子1受体核酸和蛋白表达水平均显著升高，与空白对照组相比，可显著促进局部骨折愈合及恢复。另一方面，当BMSCs 凋亡或代谢后不再驻留时，仍然可以通过损伤组织周围被激活的干细胞，激活和启动宿主自身的再生过程，继续修复受损组织[20]，这一作用的相关机制目前仍未明确。近年来，越来越多的研究关注BMSCs的“营养”生物学活性在组织再生过程中的作用。BMSCs移植后，损伤组织分泌可溶性细胞外基质糖蛋白以及一系列的营养因子，通过“细胞-细胞”直接接触的形式介导BMSCs和受损组织相邻细胞紧密接触，激活损伤周围的干细胞，参与到骨折愈合的过程，并且在急性损伤期，BMSCs可能主要通过其“营养功能”促进组织再生[21]。由此可见，移植至宿体的BMSCs的分泌功能及其对自身干细胞的激活功能在OPF治疗中也发挥着重要的作用，研究具体的分泌机制可能会带来新的突破口。

2.3BMSCs治疗骨折的相关信号通路 骨折发生时局部多细胞因子可通过激活相关信号转导途径而发挥生物学活性。Wnt信号通路是目前骨代谢相关疾病的研究热点，当条件性剔除破骨细胞中的β联蛋白基因时，会显著降低骨量，而条件性激活β联蛋白的表达后，则出现了骨量增多，表明Wnt/β联蛋白信号通路的激活可促进成骨生成，抑制骨吸收，从而促进骨折愈合[22]。相反，Yuan等[23]的实验研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR)γ是BMSCs向成骨细胞分化过程中不可或缺的转录双系调节因子，PPARγ表达减少可增强BMSCs成骨分化作用，抑制软骨分化，表明抑制PPAR信号途径的进一步激活可促进骨折的愈合。研究显示，CXC趋化因子受体[chemokine(C-X-C motif) receptor，CXCR]阳性细胞可以通过骨髓释放迁移到受损组织外周血中，且在基质细胞衍生因子趋化作用下表现为浓度升高，而加入中和抗体CXCR后，BMSCs的迁移率降至48%，表明通过激活CXCR/基质细胞衍生因子信号途径可促进迁移和归巢[24]。另外，多信号通路之间也有相互促进-抑制作用，从而在骨折治疗过程中联合发挥不同的生物学活性作用。Yuan等[23]的动物体内实验显示，激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号途径可同时有效抑制PPAR信号转导通路的激活，最终加速骨折的愈合进程。研究不同信号途径在骨折愈合过程中的正负向、上下游相关关系及其发挥作用的具体位点，有利于研究药物治疗骨折的结合靶位点及具体机制。

2.4免疫调节 当干细胞进入人体后，可减轻宿主-细胞的免疫相互反应，会更加有效地发挥BMSCs的功能。BMSCs不表达CD80、CD86和CD40，进一步抑制单核细胞和CD34+造血祖细胞分化，不能激活宿主淋巴细胞[25-28]；通过蛋白切割作用抑制自然杀伤细胞p30和g2d基因的表达，抑制自然杀伤细胞活化，从而在体内体现为低免疫原性的优点，且该特点不随着BMSCs的分化而显著改变，但会诱导免疫耐受[29]。研究证实，当BMSCs和自然杀伤细胞在体外共培养时，可有效抑制自然杀伤细胞活化、干扰素的产生及细胞毒性作用；当BMSCs与抗原特异性T细胞共同孵育时，也能抑制抗原特异性T细胞的增殖和细胞毒性作用[30]。

2.5基因调节 细胞分化受多种细胞因子、转录因子、信号转导通路和微RNA(microRNA，miRNA)的调节控制，miRNA可间接或靶点直接调节细胞因子活性、信号通路等环节，实现针对性治疗。目前逐渐开展miRNA在OPF方面的研究，但具体机制仍未明确，且研究较少。miRNA是一种小的非编码RNA，能抑制转录后基因的表达或降解其靶点。孙毅等[31]研究显示，利用小鼠BMSCs与miR-187-5p基因转染，过表达 miR-187-5p可提高碱性磷酸酶、胶原纤维蛋白-1、BMP-4、骨钙素和骨桥蛋白等成骨分化相关基因核酸的表达水平，促进BMSCs向成骨分化；而敲低miR-187-5p基因可显著降低碱性磷酸酶等成骨分化相关基因核酸的转录后表达，抑制BMSCs向成骨细胞的分化增殖。

3 BMSCs移植治疗OPF的可行性

BMSCs数量的减少或功能的缺损可直接引起骨质疏松，容易进一步导致OPF。因此，系统或局部移植正常功能的BMSCs对治疗OPF具有一定的疗效。大量动物实验研究证实，BMSCs移植可促进成骨分化，增加局部骨量，促进骨折愈合[32-35]。目前干细胞移植治疗研究集中在动物体内实验，主要包括单纯BMSCs移植、修饰后移植和新型复合材料移植。Tewari等[36]将BMSCs移植入大鼠体内3 h后，改善了局部钙结合能力。高翔等[37]通过肌内注射地塞米松建立大鼠骨质疏松性骨缺损模型，BMSCs移植术后4周可分离得到BMSCs，且显微计算机断层扫描检测结果表明，BMSCs细胞治疗能促进激素型OPF的愈合。另一方面，大量实验研究均在不断地探索并验证通过基因组织工程学技术修饰BMSCs可不同程度地提高OPF的治疗效果，而BMP-2互补DNA及其相应的重组体蛋白具有克服调节屏障的优势，显示出一定的安全性和生物学作用[38]，为OPF的治疗提供了新的可能。Xu等[39]发现，基因修饰后的BMSCs与细胞外基质混悬液可抑制脂肪细胞分化相关转录因子PPAR的表达，显著增强成骨分化能力，改善骨质疏松。邢德国[40]将BMP-2和胰岛素样生长因子1共转染的BMSCs注射于糖尿病大鼠骨折局部，结果骨密度以及骨痂最大横截面积显著改善，成熟软骨细胞分化和成骨细胞增殖显著提高。

随着研究技术及机制的不断深入，越来越多的移植方式被发明。构建复合材料对移植治疗骨折也有显著疗效，Li等[41]证实，Si@SiO2纳米复合材料(160 μg/mL，pH 7.4，37.0 ℃)的干预可以上调CXCR-4 核酸的表达水平，提高BMSCs的迁移数量，降低活性氧化物的表达，保护BMSCs免受H2O2诱导的成骨分化的抑制作用，促进大鼠股骨开放性骨折的体内愈合。Hu等[42]研究表明，合成银纳米粒子在浓度为4 μmol的特定浓度时，可诱导溴脱氧尿嘧啶核苷浓度增加，促进小鼠BMSCs增殖，利于骨折愈合。

4 小 结

骨是一种动态组织，通过成骨细胞介导骨形成的平衡作用维持其对机体的支撑作用。BMSCs可通过多种机制有效治疗骨损伤，具有广阔的应用前景。但是BMSCs移植治疗OPF还处在动物实验阶段，存在统一移植量、移植纯度和归巢率优化、移植细胞代数和治疗时间窗等问题。近年来，BMSCs相关的临床试验不断增加。在将来，OPF患者可能会取其亲代(儿子或孙子)的BMSCs进行体外增殖，以促进骨折愈合，具有操作简单、创伤小、可重复注射、免疫原性弱以及可实施性的优点，但仍需进一步的临床试验提供理论支持。同时，在手术内固定稳定的情况下，联合BMSCs移植可能更有利于骨折愈合，可能会为OPF的治疗带来更有效的临床效果。