骨性关节炎中软骨细胞死亡方式的研究进展

姜思羽，许碧莲，刘义

(广东医科大学a.药理学教研室，b.广东天然药物研究与开发重点实验室，c.海洋医药研究院，广东 湛江 524023)

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性进行性和退行性骨关节疾病，其发病年龄呈现低龄化趋势[1]。OA的主要特征为：①关节软骨的进行性退变；②骨赘的出现及形成；③滑膜炎症的出现；④软骨下骨增厚；⑤膝关节腔间隙变窄[2]。年龄增长、肥胖、应激性损伤、创伤和先天性关节异常等多种因素均可引起OA[3]。目前，广泛采用的OA治疗方法主要为使用非甾体抗炎药缓解疼痛状态以及关节置换术[4]。有文献报道，OA的主要致病原因为软骨细胞外基质的丢失和异常重建[5]。软骨细胞作为关节软骨中的唯一细胞类型，它们能对损伤做出反应，维持组织内稳态，并参与OA的软骨重建过程。正常生理情况下，软骨细胞的分化与凋亡、软骨基质的合成和分解维持动态平衡，但当OA发生时，这种平衡被打破，导致软骨基质降解，软骨细胞过度凋亡，最终引起关节软骨的退变[6]。现就OA中软骨细胞死亡方式的相关进展予以综述。

1 软骨细胞凋亡

凋亡是细胞受环境刺激后，在基因调控下所产生的一种自然死亡现象，失去作用或已经受损的细胞会在胱天蛋白酶(caspase)诱导下启动程序性自我毁灭过程，细胞凋亡属于正常的细胞周期发育。凋亡发生时，细胞的生理特征表现为细胞皱缩且密度增加、染色质浓缩，进而细胞核裂解、细胞膜内陷形成凋亡小体。体内被膜包裹的囊泡被驻留的吞噬细胞迅速吞噬，从而避免细胞内的成分暴露于免疫系统诱发炎症反应[7]。骨关节退行性病变伴随软骨细胞凋亡，被认为是OA发展的关键[8]。

1.1凋亡途径 氧化应激、内质网应激和不适当的机械信号刺激可诱导软骨细胞凋亡，诱发OA。基于上述三种刺激方式，细胞凋亡途径分为死亡受体介导的途径(即外源性途径)和线粒体介导的途径(即内源性途径)[9]。其中，外源性途径由损伤或病原体相关分子以及通过激活肿瘤坏死因子超家族受体的细胞因子诱导；内源性途径则通过响应细胞内损伤，细胞因子皱缩，DNA损伤，氧化应激或内质网应激以及胞质内Ca2+超载而触发[10]。虽然三种刺激方式激活的相关下游蛋白不同，但最终均通过激活caspase引起凋亡[11]。

1.2凋亡相关信号通路

1.2.1一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路 NO信号通路是OA软骨细胞凋亡中的促凋亡通路。软骨细胞有产生NO的能力，而NO在细胞增殖、分化甚至抵抗氧化应激方面发挥关键作用[12]。据报道，微量NO对软骨细胞没有细胞毒性，而过量NO抑制软骨细胞基质合成并导致软骨退化[13]。研究发现，关节炎患者关节滑液中能检测到高水平的NO，证明NO与OA发展之间存在联系[14]。实验证明，体内NO主要通过其供体硝普钠以内质网应激方式诱导软骨细胞凋亡，内质网应激发生后，内质网应激相关凋亡分子同源蛋白、葡萄糖调节蛋白78在软骨细胞中表达增加，从而促进软骨细胞凋亡[15]。

1.2.2自杀相关因子(factor associated suicide,Fas)信号通路 Fas信号通路是OA软骨细胞凋亡中的重要促凋亡通路。Fas受体属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族，通过接收Fas配体、Fas抗体或两者胞外部分脱落蛋白(可溶性配体)所传导的信号介导细胞凋亡。在凋亡的外在途径中，caspase-8为中心调节者。caspase-8被激活能引起caspase的断裂以及下游caspase-3、caspase-6、caspase-7的激活，从而诱导凋亡，其中caspase-3是caspase-8下游的重要靶点。此外，Fas能与其配体结合，介导caspase-8诱导Fas阳性细胞死亡，从而促进软骨细胞凋亡[16]。

1.2.3核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路 NF-κB参与多种细胞中的机体免疫、凋亡与分化、炎症反应以及肿瘤生长抑制过程的信息传递，具有促进细胞凋亡与抑制细胞凋亡的双向作用[17]。有文献报道了NF-κB信号通路在OA发展以及软骨细胞表型维持，基因蛋白表达，软骨细胞机制合成与分解中的重要作用[18]。在OA中，激活NF-κB信号通路可促进软骨细胞凋亡，从而促进OA发展。研究表明，miR-146a可以通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达和NF-κB信号通路的活化来促进OA软骨细胞的增殖并抑制其凋亡，提示NF-κB信号通路的激活可促进软骨细胞凋亡[18]。

1.2.4磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路 PI3K/Akt信号通路是OA软骨细胞凋亡中的重要抑制凋亡通路，当PI3K被细胞外信号刺激并激活时，Akt作为其靶点通过多种途径抑制软骨细胞凋亡：①直接磷酸化下游调节细胞凋亡的靶基因Bcl-xl，使其与抗凋亡因子Bcl-2解聚，抑制软骨细胞凋亡。②直接磷酸化caspase-9，caspase-9失活后抑制下游caspase-3及caspase-7的活性，从而抑制软骨细胞凋亡。③活化NF-κB，使其进入细胞核并抑制软骨细胞凋亡[19]。

1.2.5Wnt/β联蛋白信号通路 Wnt/β联蛋白信号通路在涉及细胞增殖、分化、成熟以及凋亡的生物过程中起关键作用，研究证实其稳定性与细胞稳态以及关节组织的完整性有关[20]。DKK1(Dickkopf-1)是一种Wnt/β联蛋白抑制剂，研究发现DKK1可以诱导OA软骨细胞凋亡，而抑制DKK1能减少软骨细胞凋亡，可见Wnt/β联蛋白信号通路对软骨细胞凋亡以及关节软骨的破坏具有保护作用[21]。

1.2.6p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路 MAPK亚家族包括p38 MAPK、胞外信号调节激酶和c-Jun氨基端激酶。其中，p38 MAPK信号通路在软骨组织稳态和发育中起重要作用，控制着软骨细胞的分化、增殖，细胞因子的产生、衰老和凋亡[22]。白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α可以激活p38 MAPK途径中的p38，通过一系列级联反应抑制OA软骨细胞凋亡及白细胞介素-1表达[23]。

1.3软骨细胞凋亡与OA 研究发现，OA软骨细胞凋亡的发生率远高于正常软骨细胞，发生凋亡的软骨细胞数量与软骨退化和(或)OA严重程度呈正相关[24]；另有研究发现，软骨细胞凋亡可能是OA发生的先决条件，在人类软骨中作为OA发生的起始步骤出现[25]。文献报道，细胞凋亡取决于观察到发生凋亡的软骨细胞数量增加或正常软骨细胞数量减少，甚至在相对正常的OA软骨内，研究人员发现凋亡相关基因的表达出现变化[25]。因此，软骨细胞凋亡既是调控OA发生的原因也是促进OA发展的结果，虽然软骨细胞死亡发生在骨关节炎并与软骨退化有关，但目前尚不清楚软骨退化是在软骨细胞死亡之前还是之后发生。

2 软骨细胞的自噬性细胞死亡

自噬性细胞死亡是软骨细胞的一种稳定机制，可以自我清除功能失调的细胞器和大分子，软骨细胞能通过自噬性细胞死亡来维持营养和能量的稳态，从而保护细胞免受其应激状态的影响[26]。虽然自噬不是一种细胞死亡，但它在调节细胞死亡和软骨稳态方面起重要作用。研究发现，自噬与多种疾病(包括感染、衰老、癌症、神经变性和OA)有密切关系[27]。然而，在某些特定条件下，细胞死亡也可由自噬诱导，这种由自噬引起的死亡被认为是区别于细胞凋亡(Ⅰ型程序性死亡)的另一种程序性细胞死亡(Ⅱ型程序性死亡)[28]。自噬性细胞死亡通过受到各种信号的刺激而发生，如低氧、内质网应激、能量平衡、细胞因子和生长因子。自噬性细胞死亡主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路和Ⅰ类PI3K/Akt信号通路调控，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与Ⅰ类PI3K均为自噬的负调节分子；同时，自噬性细胞死亡也可被氨基酸负性调节[29]。

软骨细胞自噬发生在连续的步骤中，每一步均通过形成特定的多蛋白复合物来控制，在此过程中，回收目标组分逐渐被双层膜包围直至被捕获在球形自噬体中。自噬溶酶体通过自噬体与溶酶体相互融合后产生，其中特定的溶酶体蛋白酶能够消化回收目标组分，并释放组分，然后被重新用于生物合成或作为能量来源[30]。

软骨细胞中自噬的触发旨在避免早期的OA软骨细胞死亡。研究发现，缺氧诱导因子-1α和缺氧诱导因子-2α的增加介导了软骨细胞对缺氧的反应，其中缺氧诱导因子-1α是自噬的正性调控因子，而缺氧诱导因子-2α是自噬的负性调控因子，缺氧诱导因子-2α在软骨细胞中介导软骨破坏及细胞死亡[31]。缺氧诱导因子-1α/缺氧诱导因子-2α是检测软骨细胞存活和(或)死亡的主要指标，它们能反映细胞死亡时倾向于自噬性细胞死亡或细胞凋亡[31]。文献报道，软骨细胞的自噬性细胞死亡与OA的发展密切相关[32]。雷帕霉素是一种有效的自噬诱导剂，对早期OA软骨细胞增殖有促进作用，而过量的雷帕霉素导致OA软骨细胞死亡；雷帕霉素诱导的自噬能消除白细胞介素-1产生的氧化应激，从而保护软骨细胞[32]。因此，自噬可能通过促进软骨细胞存活来保护关节软骨[32]。在OA中，自噬虽是软骨细胞生长的重要组成部分，但过量诱导自噬会导致软骨细胞自噬性细胞死亡。

3 软骨细胞的坏死性细胞死亡

坏死性细胞死亡主要定义为由有害刺激引起的被动、意外细胞死亡，如热、紫外线辐射、缺氧和细胞毒性抗癌药物。坏死性细胞死亡是细胞死亡的一种非编程、与caspase和能量无关的病理形式，是细胞暴露于高毒性物质或极端生理条件下发生的一种细胞死亡方式。因坏死性细胞死亡在形态学上常伴有细胞肿胀、线粒体肿胀及细胞质颗粒化，故会导致细胞质膜受损使其内容物不受控制的释放入细胞内，从而产生炎症反应[33]。

根据细胞死亡的不同形式及特点，细胞死亡模式被分为凋亡及坏死性细胞死亡两种。其中，凋亡被认为是一种调控性的细胞死亡机制。随着研究的不断深入发现，坏死性细胞死亡也能作为程序性细胞死亡途径影响软骨细胞增殖与死亡，称为“坏死性凋亡”。在分子水平上，坏死性凋亡是由许多信号通路相互作用引起，其中受体相互作用蛋白1激酶是一个中心启动子[34]。研究发现，软骨细胞中软骨寡聚基质蛋白与假性软骨发育不全相关的突变可诱导caspase依赖性坏死[35]。此外，文献报道肿瘤坏死因子-α能通过坏死性凋亡诱导软骨细胞死亡[36]。

4 凋亡、自噬性细胞死亡与坏死性细胞死亡的关系

研究发现，凋亡与自噬有密切联系[37]。自噬是凋亡发生所必需的，通常发生在凋亡之前，且自噬也是细胞为了避免死亡而进行的一种保护机制。软骨细胞凋亡可以被自噬性细胞死亡抑制，起保护软骨细胞的作用，但一旦自噬被过度激活，线粒体中的前凋亡因子就会被激活，从而发生细胞死亡。此外，自噬与凋亡还可以相互转化，从而共同促进细胞死亡。在某些条件下，当凋亡被抑制时，细胞会向自噬转化[37]。

软骨细胞凋亡与坏死性细胞死亡有关，两者在组织学水平难以区分，因为这两个过程可以独立并连续的同时发生。此外，凋亡与坏死性细胞死亡具有共同的诱导物和生物化学网络。通常可以从以下几个方面判断凋亡与坏死性细胞死亡：①细胞形态学变化。②细胞膜自身及其渗透性的改变。③寡核苷酸DNA片段化或允许DNA链断裂检测的末端脱氧核苷酸转移酶生物素-脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术。④caspase活化剂和(或)抑制剂的分析。⑤通过线粒体膜电位确定。在通路方面，凋亡与坏死性细胞死亡存在许多共同点，很多能诱导凋亡发生的因素，也可以导致坏死性细胞死亡[37]。

坏死性细胞死亡与自噬之间存在一定联系。当一些促死亡因素被自噬清除时，有利于抑制坏死性细胞死亡。同时，在某些情况下，细胞发生坏死性细胞死亡的必要条件是自噬性细胞死亡的发生[38]。

5 小 结

软骨细胞死亡的方式包括凋亡、自噬性细胞死亡和坏死性细胞死亡。它们与关节软骨的退化及OA的发生和发展均有关。目前，凋亡、自噬性细胞死亡和坏死性细胞死亡的生物化学调控机制以及三者相互作用的具体机制尚不清楚。未来，进一步深入研究它们的生物化学机制，探明它们在OA中的作用，不仅有利于加深对细胞死亡方式的理解和认识，且对选择OA治疗靶点以及研究出更高效的OA治疗药物具有重要意义。