外泌体与肺纤维化相关的研究进展

刘永骏，李婷，董昭兴

(昆明医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，昆明 650101)

肺纤维化是严重影响人类呼吸功能的疾病，其发病机制为各种原因所致肺泡上皮细胞的反复损伤、应激、凋亡，成纤维细胞发生上皮-间充质转化激活，肺基质逐渐破坏，导致肌成纤维细胞的活化和积累，同时肺泡上皮细胞不能进行正常的修复重建，最终导致肺纤维化的发生[1]。目前，尚无特效的肺纤维化治疗药物，特发性纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)确诊患者的平均生存周期仅3～5年[2]。新型抗纤维化药物(吡非尼酮和尼达尼布)可减缓患者用力肺活量的下降，但不能控制肺纤维化的进展，也不能逆转现有的肺纤维化[3]。

外泌体是由内体膜向内凹陷形成的直径为30～150 nm的细胞微囊泡，外泌体与质膜融合后释放到细胞外空间[4]。20世纪80年代后期，细胞外有外泌体存在被确定[5]。研究发现，外泌体是一种参与细胞间通讯的功能性载体[6]。外泌体广泛存在于体液中，包括血液、尿液、唾液、羊水、支气管肺泡灌洗液、母乳等[7]，可在心脏[8]、肾脏[9]、腹膜[10]等器官纤维化的发生过程及调节机制中起重要作用。现就外泌体与肺纤维化的关系予以综述。

1 外泌体概述

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)是由细胞分化、活化、衰老、转化等多种刺激诱导的一种膜囊泡，包括外泌体、凋亡小体、微囊泡，而外泌体是唯一已知的源自内膜的分泌细胞囊泡，是由多泡体向胞内出芽产生靶向质膜的腔内囊泡，其过程目前尚未完全清楚，可能与转运所需的内体分选复合物途径、神经酰胺依赖性途径有关[4,6]。

外泌体由脂质双层膜形成，其中包含蛋白质、核酸和脂质及其衍生物等。外泌体所含蛋白质包括腔内蛋白质和跨膜蛋白，如热激蛋白、四跨膜蛋白等，其中四跨膜蛋白，特别是白细胞分化抗原63和白细胞分化抗原81是常用的特异性外泌体标志物[4,6,11]。外泌体中含有的核酸包括信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA)以及长非编码RNA、环状RNA、循环DNA、线粒体DNA，在人血浆来源的外泌体RNA中miRNAs最丰富。研究表明，外泌体中的核酸参与了许多疾病过程，如肿瘤、心血管疾病、自身免疫疾病等[6,12]。外泌体富含的脂质主要包括胆固醇、鞘糖脂、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、花生四烯酸和其他脂肪酸、前列腺素和白三烯等，这些脂质不仅参与构成外泌体，还参与细胞生理病理过程[6,12-13]。研究认为，通过细胞-细胞接触与邻近细胞通讯是外泌体的最主要作用，外泌体可通过分泌的可溶性因子(如激素、细胞因子)与远处细胞通讯，还可通过电子、化学信号(如核苷酸、脂质和短肽)参与信号转导；此外，外泌体对维持组织细胞功能和调节细胞内环境稳态均起到关键作用，并可调节免疫细胞功能，从而介导免疫反应[6-7]。

根据外泌体大小、形态、浮选密度和标记蛋白的不同，外泌体的分离方法亦不同。外泌体常通过差速离心、尺寸排阻色谱、免疫亲和捕获、商用试剂盒或微流体技术从条件培养基或体液中分离获得[6,13]。目前认为超速离心法是纯化外泌体的最佳方法，可获得高纯度外泌体。实验常用的商用试剂盒一般基于大小尺寸沉淀的方法，可大幅度缩短外泌体分离的操作时间，具有高效、可靠、可重复的优点；免疫亲和捕获产量很低，但特异性较高[6,11]。纳米微流体是一种分离外泌体的新技术，具有分离速度快、纯度高和回收率高的特点，应用潜力巨大[14-15]。荧光细胞激活分选、电子显微镜、流式细胞仪、液相色谱质谱以及Western印迹法是实验室检测外泌体的常用方法。动态光散射和纳米粒子跟踪分析技术具有快速、可靠、半定量的特点，但无法通过特定大小的颗粒识别外泌体的种类。利用表面等离子体共振与对细胞外结构域外泌体膜蛋白的特异性抗体进行微阵列分析的组合定量检测和表征肿瘤来源的外泌体时，不需要富集或纯化，为检测、表征外泌体提供了简便有效的新方法[6,16-17]。目前分离和纯化外泌体的方法仍存在许多缺点和不足，仍需进一步的研究，以促进其临床应用。

2 外泌体在肺纤维化中的作用

外泌体与多种纤维化疾病相关，包括肾纤维化[18]、心脏纤维化[19]、肝纤维化[20]等。携带特定物质的外泌体不但参与了器官纤维化的发病机制，还可作为血液、尿液等体液的纤维化生物标志物，为疾病诊断提供依据[18-20]。干预外泌体携带物质以及使用干细胞衍生外泌体已成为治疗纤维化疾病的新手段[21-22]。外泌体对肺纤维化的作用，取决于其中所含物质的种类。

2.1外泌体中核酸在肺纤维化中的作用 目前，对外泌体中与肺纤维化相关核酸的研究主要集中于miRNA，含有miRNA的外泌体通过表面蛋白以配体-受体方式与细胞作用，根据外泌体所含miRNA种类的不同，对肺纤维化产生的影响不同[23]。Makiguchi等[24]对小鼠模型的研究发现，急性炎症期(第7天)和慢性纤维化期(第28天)模型小鼠血清EV miR-21-5p水平均升高；该研究进一步监测不同血清EV miR-21-5p水平IPF患者肺活量6个月并随访30个月发现，血清EV miR-21-5p水平较高IPF患者短期内肺活量下降明显，疾病进展较快，长期死亡率明显高于miR-21-5p水平较低IPF患者，故认为血清EV miR-21-5p可作为IPF疾病进展和死亡预测的生物标志物。Liu等[25]的研究发现，博来霉素诱导的纤维化小鼠以及IPF患者的肺组织miR-21水平上调，证实miR-21在肺纤维化中具有重要作用。刘理静等[26]发现，miR-21通过抑制血小板反应蛋白1型基因表达促进1型胶原蛋白和3型胶原蛋白合成，进而促进肺纤维化的发生。miR-21的外泌体参与并促进了肺纤维化的发生，且血清miR-21水平可作为判断IPF患者预后的指标。

Njock等[27]通过检测比较IPF患者与健康人群痰液中外泌体miRNA种类及含量的研究发现，miR-142-3p、miR-33a-5p、let-7d-5p三种miRNA与IPF密切相关；通过对肺部一氧化碳扩散能力/肺泡体积比的评估发现，miR-142-3p表达与肺功能呈负相关，并可通过Wnt信号通路促进间充质祖细胞正常增殖，miR-142-3p水平升高可能导致间充质细胞增殖和分化之间的平衡改变。另有研究报道，miR-142-3p过表达可能通过调节环加氧酶-2的表达和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路保护博莱霉素诱导的MLE-12小鼠肺泡上皮细胞损伤，推测含miR-142-3p的外泌体可能具有减轻肺纤维化的作用[28]。而let-7d-5p与miR-142-3p的作用完全相反，let-7d-5p下调可促进肺上皮细胞的上皮-间充质转化，从而参与IPF的病理生理过程[27]。另有报道称，miR-33a可以通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径促进肝纤维化的形成[29]。由此可见，痰液中携带miRNA的外泌体参与了IPF的发病机制，可作为IPF诊断的生物标志物。Yao等[30]研究发现，肺纤维化大鼠模型miR-328的表达上调，且参与抗炎作用的M2型巨噬细胞分泌的含有miR-328的外泌体可靶向作用于FAM13A基因并下调其表达，刺激肺间质成纤维细胞的增殖。由此可见，肺纤维化患者或肺纤维化动物模型外泌体的miRNA种类及含量均发生了变化，提示含有miRNA的外泌体参与并调控IPF疾病的发生。

2.2外泌体中蛋白质在肺纤维化中的作用 外泌体中的蛋白质包括跨膜蛋白和内含蛋白，其中内含蛋白在肺纤维化过程中起重要作用。内皮细胞通过外泌体的非经典途径分泌热激蛋白70[31]。与野生型小鼠相比，热激蛋白70过表达可改善转基因小鼠博来霉素诱导的肺损伤和炎症反应，抑制肺纤维化和肺功能障碍，且转化生长因子-β1和促炎细胞因子的表达水平较低[32]。

Wnt信号通路是由配体Wnt蛋白和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道信号转导途径，是器官和组织发育的必需途径，也是导致各种器官纤维化的主要原因之一[33]。Dziao等[34]的研究发现，小鼠成纤维细胞可分泌含有Wnt3a和Wnt5a的外泌体，Wnt3a可特异性地激活成纤维细胞的Wnt/β联蛋白途径，与转化生长因子-β共同作用，增强成纤维细胞的促纤维化反应。但含有Wnt5a外泌体不依赖β联蛋白发挥作用，而是通过激活蛋白激酶1/2和激活子蛋白1的非经典途径，诱导促纤维化的白细胞介素-6的产生。有研究发现，IPF急性发作患者白细胞介素-6水平显著升高[35]。Marin-Medina等[36]研究发现，Wnt5a在IPF患者和肺纤维化小鼠模型肺泡灌洗液EV中上调，而肺成纤维细胞是Wnt5a EV的主要来源。对原代肺成纤维细胞的研究发现，原代肺成纤维细胞衍生的EV或IPF支气管肺泡灌洗液中的EV均可以通过内含的Wnt5a诱导原代肺成纤维细胞的增殖，但不能诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化[37]。

除蛋白质外，外泌体还含有蛋白酶。蛋白酶/抗蛋白酶失衡是许多慢性肺病的标志，其中蛋白酶靶向细胞外基质组分以降解、破坏组织结构，并释放细胞外基质衍生的生物活性信号，导致炎症持续存在。Szul等[38]报道了一种调节人类肺部疾病中的慢性中性粒细胞炎症反应至关重要的蛋白酶——脯氨酰肽链内切酶，脯氨酰肽链内切酶可裂解胶原片段并释放一种重要的中性粒细胞趋化剂——三氨基酸序列脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸，可见脯氨酰肽链内切酶存在于人类气道上皮细胞，由外泌体释放并受模式识别受体Toll样受体4的调节。另有研究发现，中性粒细胞趋化因子脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸以及受香烟烟雾成分刺激乙酰化的脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸具有抗纤维化的作用，并分别在白三烯A4水解酶和血管紧张素的作用下降解，故含有脯氨酰肽链内切酶的外泌体可能减少肺纤维化的发生[39]。由此可见，外泌体中不同的内含蛋白可通过不同途径直接或间接促进或抑制肺纤维化。

2.3外泌体中脂质及其衍生物在肺纤维化中的作用 肺间质成纤维细胞分化为可收缩的肌成纤维细胞，并增殖和分泌过多的细胞外基质是肺纤维化发病机制的关键，而某些脂质信号分子(如前列腺素)可抑制肌成纤维细胞的分化。研究发现，促炎细胞因子白细胞介素-1β作用于原代人肺成纤维细胞可诱导环加氧酶-2表达，并产生含有前列腺素E2的EV，EV通过抑制转化生长因子-β诱导的肌成纤维细胞分化和细胞外基质产生而发挥抗肺纤维化作用；此外，以上源自肺成纤维细胞的EV还可通过自分泌与旁分泌作用传递抗纤维化信号，在一定程度上证实了活化的成纤维细胞对附近幼稚成纤维细胞存在显著抗纤维化作用[40-41]。既往研究表明，花生四烯类代谢物白三烯是肺纤维化的重要调控因子，且IPF患者支气管肺泡灌洗液和肺组织中白三烯B4水平升高[42-43]。Majumdar等[44]研究发现，在中性粒细胞趋化过程中，白三烯B4在细胞多囊泡中以外泌体方式分泌，可见含有白三烯B4外泌体与肺纤维化的形成密切相关。

3 干细胞源性外泌体对肺纤维化的作用

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于中胚层组织中的多能干细胞，可从骨髓、脂肪组织、血液、胎盘和脐带等各种组织及器官中分离。Willis等[45]的研究表明，MSCs衍生的外泌体可改善肺形态和发育，减少肺的纤维化，改善肺血管重塑。Tan等[46]对人羊膜上皮细胞衍生的外泌体与人肺成纤维细胞所衍生的外泌体进行比较发现，人羊膜上皮细胞衍生的外泌体富含更多的与细胞凋亡、细胞发育生长、促分裂原活化的蛋白激酶、炎症、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子相关通路的蛋白质，可靶向磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路、促分裂原活化的蛋白激酶途径、Ras蛋白途径、Hippo蛋白激酶途径、转化生长因子-β、黏着斑信号转导通路等纤维化相关信号转导途径的miRNA，发挥抗炎、抗纤维化、促进小鼠支气管干细胞再生的作用。Fujita等[47]发现，MSCs衍生的EV通过抑制炎症反应、减少氧化应激改善各种肺部炎性疾病所造成的肺组织重塑和纤维化。Shentu等[48]研究证明，MSCs衍生的EV通过胸腺细胞表面糖蛋白1与整联蛋白β相互作用后促进成纤维细胞对MSCs衍生的EV摄取，进而抑制转化生长因子-β1诱导的肺成纤维细胞中α平滑肌激动蛋白的表达，降低纤维粘连蛋白和胶原蛋白Ⅲ的表达，抑制肺成纤维化细胞向肌成细胞分化，从而减轻肺纤维化。将MSCs衍生的外泌体作为肺纤维化的治疗方案是目前的研究热点，但MSCs衍生外泌体发挥抗肺纤维化的机制尚不完全清楚，仍需进一步探索。

4 小 结

外泌体作为一种携带核酸、脂质、蛋白质等物质的功能性载体，在肺纤维化发生和进展过程中起重要作用。携带某一特定物质的外泌体可促进肺纤维化的发生，而携带另一些特定物质的外泌体又能发挥抗肺纤维化的作用。外泌体的相关研究有助于解释肺纤维化的发病机制以及调控肺纤维化的疾病进展。目前，对外泌体的认识十分有限，随着研究的不断深入，与肺纤维化相关的外泌体内含物及作用机制将逐渐被揭示。未来外泌体将有望成为临床诊断、治疗肺纤维化的重要手段。