长链非编码RNA在血管平滑肌细胞中的研究进展

谢中杰，袁晓晨，龚开政

(扬州大学附属医院心血管内科，江苏 扬州 225000)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是构成血管壁组织结构和维持血管张力的主要细胞成分，其生物学行为的改变(如表型转换、各种原因引起的增殖、凋亡)是高血压、动脉粥样硬化、经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础，病理性刺激可诱导具有收缩功能的分化型转变为具有增殖和迁移能力的去分化型，成人血管内的VSMC以极低的速率增殖，且合成活性较低[1-2]。早期对VSMC的研究集中于许多蛋白质信号通路，包括经典的G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶参与的调节VSMC对环境刺激和生长因子的反应。近年来，许多非蛋白质机制和转录后机制[如非编码单链RNA即微RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)介导的机制]在VSMC中发挥作用[3]。非编码RNA一直处于研究的最前沿，参与正常细胞过程、疾病状态下的功能失调。通过对lncRNA进行研究可以为VSMC的作用以及可能的相关调控机制提供新的见解。现对lncRNA与VSMC研究的最新进展进行综述。

1 lncRNA概述

1.1lncRNA的概念 lncRNA是指长度大于200个核苷酸且通常不编码蛋白质的DNA转录产物，根据染色体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为正义、反义、双向、基因间、基因内五种类型，lncRNA在不同组织间表达量不同，在同一组织不同生长阶段也存在差异，与蛋白质编码基因相比，lncRNA能显示出更多的组织特异性，在lncRNA发现早期，人们认为lncRNA并不具有生物学功能，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，后来发现lncRNA在基因表达调控和维持正常细胞功能方面具有重要生物学功能[4-5]。

lncRNA可以通过表观遗传、转录和转录后的功能机制调节基因表达，通常根据其细胞定位调节众多细胞生长过程而发挥强大的生物学调节功能，如定位于细胞核中的lncRNA可通过引导或隔离转录因子、诱导组蛋白修饰、将染色质重塑复合物引导至正确的染色体位置或充当增强子RNA来调节转录[6]。在细胞质中，lncRNA可以作为miRNA海绵或充当蛋白质复合物的“支架”调节mRNA稳定性并控制翻译过程，还可参与蛋白质磷酸化和信号转导通路的激活。此外，一些lncRNA可在外泌体或微囊泡中释放，促进细胞间通讯。

1.2lncRNA与平滑肌细胞表型转化 平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化的过程称为表型转化，表型转化是冠心病、冠状动脉支架术后再狭窄、脑卒中、动脉瘤等血管疾病发生和发展的重要步骤[7]。肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)已被确立为体内血管生成的重要调节剂，一项胸主动脉瘤相关平滑肌细胞功能的研究发现，MALAT1可与组蛋白去乙酰化酶9和染色质重塑酶Brahma相关基因1的免疫沉淀物结合，MALAT1表达的沉默可抑制该免疫沉淀物的稳定性，从而降低基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性，下调增殖相关标志物的表达，如增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白D1和骨桥蛋白基因，促使平滑肌细胞从合成表型转化为收缩表型，且细胞周期停滞在G2期[8]。

心肌素蛋白是血清应答因子的转录共激活因子，通过与血清应答因子结合形成复合物，激活顺式作用元件CArG盒依赖的平滑肌特异性基因(如α-平滑肌肌动蛋白的活性)，从而调节平滑肌细胞的表型转化[9]。MYOSLID(MYOcardin-induced Smooth muscle Long non-coding RNA)是一种VSMC特异性表达的lncRNA，是心肌素蛋白/血清应答因子和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路的直接转录靶标，可促进纤维型肌动蛋白的组装，通过心肌相关转录因子A核转位和下游VSMC收缩基因的转录激活，进而稳定VSMC的收缩表型[10]。

lncRNA核富含丰富的转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,NEAT1)由人第11号染色体MEN1基因位点转录而来，已被证实在多个肿瘤发生发展中起关键作用。Paraspeckles是一种位于哺乳动物细胞染色体间区、由NEAT1与多种RNA结合蛋白构成的新型细胞核亚结构小体，Wang等[11]发现，NEAT1在响应来源于线粒体损伤的信号时通过增强Paraspeckles对细胞核内转录的具有调控线粒体功能的信使RNA的核滞留以反馈调节线粒体相应的生理过程，影响线粒体形态、耗氧速率、ATP合成能力，导致线粒体功能紊乱，最终影响平滑肌细胞的增殖速率。Ahmed等[12]进一步研究发现，NEAT1可通过结合表观遗传活化剂WDR5(WD repeat-containing protein 5)蛋白而阻断组蛋白甲基转移酶1与WDR5相互作用，从而调控组蛋白甲基转移酶1催化功能，减少血清应答因子与平滑肌特异性基因启动子内的CArG盒的结合，抑制平滑肌收缩相关蛋白表达进而促进平滑肌细胞增殖和迁移。

Bell等[13]对人冠状动脉VSMC进行RNA测序，发现SENCR(Smooth muscle and Endothelial cell enriched migration/differentiation-associated long Non-Coding RNA)是一种新型细胞质定位的lncRNA，降低SENCR表达可导致心肌素及平滑肌收缩相关的基因表达下调，且许多迁移相关的基因表达升高，可稳定平滑肌细胞收缩表型；进一步研究发现SENCR可响应于层流剪切应力变化，其通过与细胞骨架相关膜蛋白4的物理结合促进内皮细胞黏着连接完整性，对于维持血管内皮的完整同样具有重要作用[14]。

1.3lncRNA作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)调控平滑肌细胞 miRNA是20～25个核苷酸的非编码RNA，其基于对靶基因信使RNA 3′非翻译区的序列特异性调节其稳定性、翻译过程，既往研究发现miRNA的异常水平与多种疾病相关[15]，ceRNA假说支持lncRNA可通过隔离miRNA活性，从而上调miRNA靶基因表达[16]。MALAT1作为ceRNA通过结合miR-142-3p调节细胞自噬相关基因的表达，减弱人血小板衍生生长因子BB诱导的平滑肌细胞增殖和迁移[17]。Lin等[18]在研究高糖对VSMC钙化、衰老的影响时发现，lncRNA-ES3与miR-34c-5p结合，作为miR-34c-5p的ceRNA，增强miR-34c-5p的靶基因BMF(Bcl-2的修饰因子)的表达调控VSMC凋亡。Wang等[19]发现母系表达基因3在氧化型低密度脂蛋白处理的VSMC中下调并与miR-361-5p呈负相关，可作为miR-361-5p的内源性海绵调节高密度脂蛋白转运相关基因ABCA1表达，进而抑制VSMC的增殖和凋亡。ceRNA假说的提出对于预测未知功能的lncRNA具有重要意义。

1.4lncRNA参与调控的信号通路 lncRNA作用机制比较复杂，能与信使RNA、DNA及蛋白质相互作用，参与调节VSMC对环境刺激和生长因子的反应，在多种信号通路中发挥作用。生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)是通过消减杂交筛选出的lncRNA，在某些环境因素影响下(如营养匮乏、低氧诱导)，可竞争性抑制激活型糖皮质激素受体与靶基因结合，切断糖皮质激素信号通路的转导，进而导致平滑肌细胞生长停滞甚至凋亡[20]。有研究表明，lncRNA-GAS5还与高血压血管重塑有关，GAS5可通过Wnt/β联蛋白信号通路转导调节VSMC功能[21]；另外，GAS5还可通过多个Smad结合元件竞争性结合Smad3蛋白，作为分子诱饵负向调节TGF-β/Smad3信号通路，从而抑制TGF-β诱导的VSMC分化[22]。

1999年首次发现了类固醇激素受体RNA激活剂(steroid receptor RNA activator，SRA)，SRA作为RNA存在能共激活多个类固醇激素受体[23]。Zhang等[24]通过构建股动脉损伤小鼠模型发现，过表达lncRNA-SRA可以通过促进VSMC增殖和迁移促进损伤后新内膜增生，生物信息学预测lncRNA-SRA与cAMP应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)相互作用。另有研究发现CREB可通过增强环腺苷酸信号转导在VSMC中发挥促有丝分裂特性，且VSMC增殖与CREB激活有关，随后实验证实lncRNA-SRA还可通过激活分裂原活化抑制剂和胞外信号调节激酶磷酸化激活促分裂原活化的蛋白激酶信号通路转导，进而导致磷酸化的CREB增加[25]。

p53是参与细胞增殖和凋亡的肿瘤抑制基因，在动脉粥样硬化进展中也起重要作用。Wu等[26]发现lncRNA-p21的表达在ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块中显著下调，可参与p53依赖性靶基因表达的调节而不改变p53本身的表达水平，可直接与E3泛素连接酶MDM2相结合，导致p53从MDM2释放并与组蛋白乙酰化酶p300结合，反馈增强p53的转录活性，促进VSMC增殖，调节损伤诱导的新生内膜形成。

2 lncRNA与VSMC相关血管疾病

2.1lncRNA与动脉粥样硬化 通常情况下，血管中膜的平滑肌细胞可以维持血管张力及结构的完整性，当血管内皮细胞受损时，平滑肌细胞会发生表型转换，迁移到损伤的血管内膜，发生增殖异常及分泌大量细胞外基质，参与动脉粥样硬化早期纤维帽的形成；晚期VSMC迁移能力增加，是不稳定性斑块破裂、继发出血和形成血栓的主要原因之一。在关于lncRNA的早期研究中，Ballantyne等[27]通过白细胞介素-1α和血小板衍生生长因子处理人大隐静脉来源的VSMC，通过RNA测序的方法寻找差异表达的lncRNA，将lncRNA RP11-94A24.1高表达，命名为SMILR，与刺激呈时间依赖性表达增加，后联合正电子发射计算机断层成像在不稳定动脉粥样硬化斑块患者中得以验证，证实了与动脉粥样硬化之间的相关性。

心肌梗死是环境与遗传因素共同导致的多基因遗传病，全基因组关联研究发现染色体9p21上单核苷酸多态性增加动脉粥样硬化和心肌梗死的风险[28]。在染色体9p21.3位点附近存在CDKN2A/B抑癌基因，编码蛋白p16INK4a、p14ARF和p15INK4b。Motterle等[29]发现rs1333048、rs1333049位点促进VSMC增殖并减少p16INK4a和p15INK4b的表达，9p21区域上风险等位基因与冠心病风险增加之间的关联部分归因于VSMC的增殖。INK4基因座中反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)是CDKN2A/B基因丛转录的一种lncRNA，一些风险单核苷酸的多态性会增加动脉粥样硬化斑块和外周血中ANRIL转录物的表达，且与动脉粥样硬化的严重程度呈正相关[30]；多梳家族蛋白是一组参与转录基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性复合物1/2两种多蛋白复合物形式，多梳抑制性复合物1能通过单泛素化组蛋白H2A参与靶基因沉默的维持，多梳抑制性复合物2能通过催化K27H3的甲基化参与基因沉默的启动，ANRIL能特异的结合多梳抑制性复合物2亚基和多梳抑制性复合物1亚基并调控CDKN2A/B位点的组蛋白修饰，促进异染色质形成，用作动态调节转录活性的分子支架，启动并维持CDKN2A/B位点的基因沉默，最终影响平滑肌细胞增殖[31]。lncRNA ANRIL已显示出对VSMC增殖的强大调节功能，可以作为动脉粥样硬化的潜在生物标志物和治疗靶标。

视网膜非编码RNA3(retinal non-coding RNA3，RNCR3)最初被认为在小鼠视网膜发育期间表达，Shan等[32]发现在高脂饮食ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中lncRNA-RNCR3也显著表达，实验证实RNCR3敲低加重了高脂血症及炎症因子的释放，减少了小鼠碱烧伤诱导的角膜新血管生成，降低了胸主动脉的VSMC增殖、迁移能力，表明RNCR3可能在动脉粥样硬化中发挥保护作用，进一步研究发现lncRNA-RNCR3还可在内皮细胞中通过竞争性结合miR-185-5p上调转录因子Krüppel样因子2的水平，使内皮细胞表达和分泌的RNCR3可以包装到外泌体中传递给平滑肌细胞从而发挥作用。

2.2lncRNA与血管紧张素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)及高血压 Ang Ⅱ 是一种小多肽激素，VSMC上有血管紧张素受体，已成为原发性和继发性高血压分型诊断、治疗、研究的重要指标。Leung等[33]研究Ang Ⅱ 相关的lncRNA发现，lnc-Ang362竞争性结合miR-221和miR-222。既往研究表明miR-221和miR-222可与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p57Kip2和p27Kip1基因结合，负责AngⅡ诱导的VSMC增殖，证实lnc-Ang362是AngⅡ相关心血管疾病的治疗靶点[34]。

一项比较高血压患者和健康对照人群lncRNAs差异表达的研究发现，高血压患者血浆中lncRNA-AK098656显著上升，进一步研究发现AK098656可与肌球蛋白重链11、纤连蛋白FN1的必需成分结合，诱导VSMC合成表型，并促进两者通过蛋白酶体介导降解，进而在细胞质中充当核酸骨架的作用，最后还通过构建AK098656转基因大鼠模型加以验证[35]。

2.3lncRNA与腹主动脉瘤 VSMC表型转变和凋亡、管壁中弹性蛋白和胶原的降解、T淋巴细胞的积累和新血管形成是动脉瘤疾病发生发展的关键过程。Li等[36]通过Ang Ⅱ /ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤模型发现lncRNA H19高表达，利用位点特异性反义寡核苷酸敲低H19可显著限制小鼠模型中动脉瘤生长，在细胞核中，H19可与缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)α亚基启动子区域结合并招募转录因子Sp1，增强HIF-1α的表达；另外，H19的二级结构可以结合HIF-1α蛋白将其保留在细胞质中，细胞质内增加的HIF-1α直接与MDM2蛋白相互作用参与p53信号通路引发的平滑肌细胞凋亡，加速了腹主动脉瘤的发生。基因间lncRNA-PVT1为人类浆细胞瘤多样异位基因1(plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1)的转录产物，Zhang等[37]发现lncRNA-PVT1在腹主动脉瘤患者组织样本中高表达，敲减PVT1治疗可以通过减少VSMC凋亡、细胞外基质破坏和促炎细胞因子的表达，抑制AngⅡ诱导的腹主动脉进行性扩张。

3 小 结

非编码RNA的发现是生命科学的重大突破，除参与各种生物过程外，非编码RNA在疾病诊断和治疗方面的潜力得到认可，血浆lncRNA H19已被认为是胃癌的生物标志物[38]。Amodio等[39]通过在体动物实验证实GapmeR靶向MALAT1能够降低多发性骨髓瘤活动性，突出了靶向lncRNA的治疗潜力。Abudayyeh等[40]证实CRISPR/Cas13a技术能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA，达到RNA干扰相似效率，有更强特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。美国食品药品管理局及欧盟委员会批准ONPATTROTM(Patisiran)用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性成人患者[41]，治疗其第一阶段或第二阶段多发性神经病变，可沉默遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关信使RNA的表达，减少周围神经中淀粉样物质的沉积，成功实现干扰小RNA分子治疗疾病的临床转化。lncRNA能够调节VSMC的增殖、迁移和基质合成且均参与病变形成，尽管最近取得了一些进展，但大多数在调节VSMC表型转换中发挥重要功能的lncRNA仍有待鉴定。