黏膜固有免疫屏障在真菌性鼻窦炎发病中的研究进展

刘海宁，杨国棠，陈长康，杨贵

(1.深圳市龙岗中心医院耳鼻咽喉科，广东 深圳 518172； 2.广州中医药大学深圳临床医学院，广东 深圳 518116)

黏膜固有免疫屏障包括黏膜组织屏障、固有免疫细胞和固有免疫分子。鼻腔鼻窦的黏膜组织屏障即黏膜上皮屏障，涉及上呼吸道调节细胞旁液体运输、免疫致敏和疾病进展的关键稳态控制机制，是炎症过程的调节剂和靶标，相关研究主要针对维持物理屏障的紧密连接和黏附连接。鼻窦固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)与致病真菌结合，继而对致病真菌产生免疫应答级联反应。白细胞介素(interleukin，IL)家族和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(marray serine proteinase inhibitor，Maspin)两类固有免疫分子均可与固有免疫细胞相互影响，并共同参与适应性免疫应答的启动和效应过程。异常真菌微生物组受地域、真菌性鼻窦炎(fungal rhinosinusitis，FRS)分型和患者年龄等因素影响，不同分型FRS对黏膜组织屏障和固有免疫细胞的影响不同，镜下可见部分区别。真菌等吸入病原体和异物引起的损伤首先由上皮细胞的物理屏障阻止，继而激活固有免疫细胞和分子阻止真菌侵入，其中某一环节的异常都可能使机体处于FRS的易感状态[1]。FRS患者的异常真菌微生物组和固有免疫屏障缺陷导致真菌抗原暴露增加，固有免疫细胞和适应性免疫应答过度代偿，FRS与慢性细菌性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)的免疫屏障假说相似[2]。现就FRS黏膜屏障中真菌定植的特点、黏膜固有免疫屏障各组分缺陷在FRS发病机制中的作用予以综述。

1 FRS致病真菌的种类

真菌在人类生存环境中普遍存在。地域是影响鼻黏膜定植真菌种类的因素之一，可影响FRS分型及其临床表现。不同地区微生物种群中细菌、真菌、病毒的丰度和种类存在一定差异[3]，故不同地区的常见FRS致病真菌亦存在差异。曲霉菌是亚欧大陆最常见的FRS致病真菌，亚洲以黄曲霉最常见[4]。同一地区不同分型FRS的常见真菌也有一定区别。曲霉菌属是我国FRS的最主要致病真菌，以黄曲霉、烟曲霉和黑曲霉最常见[5-7]。赵海等[5]对真菌球型(fungus ball，FB)鼻窦炎致病菌群的分析发现，FB鼻窦炎患者合并细菌感染时，中青年患者以革兰阳性菌感染为主，而老年患者革兰阴性菌的检出率远远高于中青年患者。胡春华等[6]对变应性真菌性鼻窦炎(allergic fungal rhinosinusitis，AFRS)患者的致病真菌培养分析发现，曲霉菌属与非曲霉菌属与骨质侵蚀的发生无明显相关性，此外，对曲霉菌属感染AFRS患者的小样本统计发现，感染烟曲霉菌和黄曲霉菌AFRS患者骨质侵蚀发生率的差异较大，仍需大样本研究的证实。耿佳靖等[7]分析侵袭性真菌性鼻窦炎(invasive fungal rhinosinusitis，IFRS)致病菌群发现，毛霉菌属是仅次于曲霉菌属的常见致病真菌，与曲霉菌属相比，根毛霉属真菌更易引起侵袭性感染，应引起重视。此外，分析方法、鼻腔解剖变异、抗菌药物的使用、采样方法、疾病亚组、纳入病例的疾病表型、人际微生物群的变异等因素均可影响微生物组的研究。

2 各型FRS的黏膜镜下组织病理学改变

定植真菌种类不同，FRS临床表现和分型不同，镜下特点也不同。FB的特征是真菌缠结团，周围常可见纤维蛋白脓性物质，无肉芽肿反应，Grocott银染色可见真菌生物体嵌入急性炎症和纤维蛋白渗出物中，但无组织侵袭。AFRS组织学检查真菌形式的特征在于存在层状黏液物质、嗜酸粒细胞或碎片和Charcot-Leyden晶体。Crist等[8]发现，致病真菌生物体具有血管侵袭倾向，伴真菌性血管血栓坏死是急性IFRS的镜下特点；曲霉菌与毛霉菌引起的急性IFRS在坏死的最后阶段多伴有无定形外观，但曲霉菌致病时无定形外观的潜在组织结构和组件可被不同程度地识别，并不是所有结构的完全丧失；毛霉菌致病时残余物可能仅有模拟纤维蛋白的筛网或网状网络，提示毛霉菌的侵袭性更强，与耿佳靖等[7]的临床研究结果相似。Kimura[9]研究发现，慢性IFRS黏膜等组织的菌丝浸润与急性IFRS相似，表明增殖菌丝体可侵犯炎症细胞组织，以炎症细胞菌丝浸润和组织破坏为主，中性粒细胞是主要的炎症细胞，此外还包括淋巴细胞、浆细胞和多核巨细胞。由于菌丝几乎不侵入血管，故因循环障碍引起的组织坏死较少见。不同定植真菌种类和分型FRS的镜下特点反映了真菌的感染程度。

3 与FRS相关的黏膜固有免疫屏障缺陷

3.1黏膜上皮屏障 顶端连接复合物是极化上皮细胞侧膜顶端的选择性渗透屏障，可将腔内容物与间质组织分开，调节细胞旁转运和细胞间黏附[10]。细胞连接和细胞黏附是顶端连接复合物的结构基础和基本方式。

近年来，关于鼻黏膜上皮屏障的细胞连接的研究主要针对紧密连接。参与紧密连接的分子包括密封蛋白(Claudin)家族等。蛋白质组成对上皮紧密连接处的细胞旁通透性起决定性作用，Claudin-2、Claudin-10、Claudin-15和Claudin-16可提高细胞旁通透性，而Claudin-1、Claudin-4、Claudin-5、Claudin-8、Claudin-11、Claudin-14和Claudin-19降低细胞旁通透性。Den Beste等[1]通过未添加炎症细胞因子的体外气液界面模型对AFRS患者原代鼻窦细胞的研究发现，AFRS患者原代鼻窦细胞跨上皮电阻增加，即上皮通透性增加。对未添加炎症细胞因子模型的研究发现，AFRS表型代表从体内表型中蛋白质表达的保留修饰，表明真菌变应原暴露可上调辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)2细胞因子的表达，引起紧密连接相关蛋白的表达改变，进而使上皮通透性升高。Wise等[10]进一步将体外气液界面模型分别暴露于IL-4、IL-5、IL-13三种Th2细胞因子的研究发现，暴露于鼻窦上皮的IL-4、IL-13剂量与Claudin-2表达水平升高呈正相关，并与鼻窦上皮变异性提高有关；IL-5可使Claudin-2表达水平升高，但与剂量无关。由此可见，IL可影响鼻窦上皮的紧密连接，进而提高上皮细胞通透性，破坏黏膜固有免疫屏障，加重上皮真菌暴露。

鼻黏膜屏障处细胞表面的黏附分子家族包括跨膜蛋白上皮钙黏素和细胞外蛋白骨膜蛋白等，上皮钙黏素和骨膜蛋白均可维持肌动蛋白结合。遗传缺陷、损伤、感染或炎症引起的屏障结构蛋白表达减少可能导致屏障功能的丧失[11]。Jiang等[12]对FB鼻窦炎患者鼻组织的分析发现，FB鼻窦炎患者鼻黏膜上皮钙黏素的表达减少，且上皮钙黏素表达较少与部分真菌感染或呼吸系统疾病相关的单核苷酸多态性患病率较高有关。可见，FB鼻窦炎患者鼻黏膜免疫或屏障功能可能具有遗传性或获得性缺陷，致使真菌菌丝在鼻窦累积。黏附连接缺陷为致病真菌在鼻窦的生长繁殖创造了条件。

成纤维细胞有助于AFRS中的组织重塑和炎症细胞的募集，与机体固有免疫应答的代偿相关。Carroll等[13]研究发现，AFRS患者鼻窦成纤维细胞数量显著高于CRS和非炎症性鼻窦疾病患者，AFRS成纤维细胞的数量与疾病严重程度相关。过度代偿的2型炎症引起的纤维蛋白沉积可能有利于局限和破坏真菌等病原体[14]。其中肌成纤维细胞产生的纤连蛋白、肌腱蛋白和骨膜素可形成临时基质，保护上皮屏障。骨膜素作为细胞外基质蛋白参与细胞黏附，可调节嗜酸粒细胞募集和Th2细胞黏膜炎症，并参与减少其他细胞因子引发黏液产生的负反馈循环，在鼻窦炎症中具有重要作用。Laury等[15]使用免疫荧光标记和共聚能显微镜检测鼻窦组织骨膜蛋白水平的研究发现，AFRS患者鼻窦组织标本中骨膜蛋白水平明显高于炎症性鼻窦疾病患者，且骨膜素与AFRS严重程度呈正相关，随后Tyler等[16]也取得了与其一致的研究结论。

3.2固有免疫细胞的PRR 鼻窦组织表达的涉及宿主对真菌免疫应答级联反应的PRR有蛋白酶激活受体(protease activated receptors，PAR)和Toll样受体(Toll like receptor，TLR)等。

微生物成分与免疫系统间存在相互作用，真菌蛋白酶通过PAR2诱导胸腺基质淋巴细胞生成素产生，进而导致Th2细胞活化，产生IL-13和IL-5[17]。Dietz等[18]用烟曲霉各组分刺激原代培养人鼻腔上皮细胞的研究发现，真菌蛋白酶可诱导IL-33表达，且PAR2表达升高，故推测烟曲霉的丝氨酸蛋白酶可通过PAR2诱导IL-33表达。对基因表达谱的研究显示，变应原真菌蛋白酶对PAR的影响不限于PAR2。Ebert等[19]采用微阵列技术的研究发现，变应原真菌蛋白酶还可促进AFRS患者PAR3表达，并增强Th2细胞应答。但Sawhney等[20]的聚合酶链反应发现，AFRS患者PAR1、PAR2、PAR3表达均明显高于CRS患者，故推测PAR2、PAR3参与了真菌蛋白酶触发的炎症级联反应。PAR1基因的差异可能与印度次大陆与美国FRS病原体或基因表达检测方法的差异有关。综上所述，真菌蛋白酶可改变蛋白水解活性，调节PAR，增强Th2细胞应答，并可与IL-25协同作用，且以上作用可能发生于早期诱导的固有免疫应答之前。

鼻窦上皮细胞和免疫细胞主要识别真菌的TLR，包括TLR2、TLR4、TLR5和TLR9，4种识别真菌的TLR均可介导核因子κB的激活，进而激活炎症介质和宿主防御分子的表达，发挥非特异性免疫功能。Shin等[21]研究发现，链格孢菌和曲霉菌可提高原代鼻息肉组织成纤维细胞TLR2和TLR5信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达，促进IL-6和IL-8的产生，此过程还涉及1,25-二羟维生素D3修饰的促炎细胞因子反应。Li等[22]发现，烟曲霉可诱导1,25-二羟维生素D3缺乏小鼠巨噬细胞中参与烟曲霉识别的关键PRR(TLR2、TLR4和dectin-1等)的上调，并提高肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子的表达，以上PRR和促炎细胞因子基础水平的升高可导致烟曲霉素激发后趋化因子表达的持续和增强，这种宿主炎症反应的加剧或失调可能与宿主对烟曲霉抗性受损有关，并引发广泛的组织损伤，进而加重炎症，导致不良预后。Mostafa等[23]发现，AFRS患者血清1,25-二羟维生素D3水平显著低于无鼻息肉CRS患者和健康人群。Schlosser等[24]发现，AFRS患者鼻窦1α-羟化酶和1,25-二羟维生素D3均显著低于无鼻息肉CRS患者和健康对照人群。由此可见，TLR可促进IL的表达和固有免疫应答的失代偿，此过程可能受到1,25-二羟维生素D3和上皮钙黏素减少的影响。

3.3固有免疫分子

3.3.1IL IL是一类研究较多的固有免疫分子。Kale等[25]比较嗜酸粒细胞相关FRS、非嗜酸粒细胞鼻窦炎以及健康个体血清细胞因子的研究发现，嗜酸粒细胞相关FRS患者血清IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、肿瘤坏死因子-α和γ干扰素的水平升高，且明显高于非嗜酸粒细胞鼻窦炎以及健康个体，其中，以IL-4和IL-10的水平最高；研究还发现，嗜酸粒细胞相关FRS患者绝对嗜酸粒细胞计数升高与Th1/Th2细胞因子水平之间呈显著正相关，提示嗜酸粒细胞相关FRS存在Th1和Th2细胞因子应答。目前，以临床观察为切入点，根据测得适应性免疫应答启动后IL-1β、IL-8、IL-17、IL-21、IL-25水平的变化推测早期诱导的固有免疫应答阶段IL变化的研究正在进行。

IL-17和IL-21涉及AFRS患者局部Th17/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)的平衡失代偿。Rai等[26]研究发现，AFRS患者血清免疫球蛋白E以及细胞因子IL-17、IL-21、IL-1β、转化生长因子-β的水平较健康人群升高，但IL-2和IL-10水平降低；并通过测定外周血单个核细胞实时分析视黄酸相关孤儿核受体和叉头转录因子细胞内mRNA表达发现，AFRS患者血清Th17和成熟Treg细胞数量均较对照组增多，但功能较对照组低。推测Treg细胞功能障碍导致IL-2和IL-10降低以及Th17升高失控，而Treg细胞代偿性增加导致抑制Treg细胞和促进Th17细胞途径的IL-1β和转化生长因子-β升高，加剧Th17/Treg细胞失衡，使AFRS患者陷入IL-17和IL-21升高的恶性循环，进一步增强Th17细胞驱动的适应性免疫应答，导致炎症恶化，并加剧临床状况和疾病进展的严重程度，从而说明了AFRS致病真菌能够长时间维持感染并维持免疫反应。

周明辉等[27]用真菌提取物和IL-25分别刺激体外培养鼻黏膜上皮细胞和组织对早期诱导的固有免疫应答进行研究显示，真菌可引起AFRS患者鼻黏膜上皮细胞的IL-25表达强度升高，IL-25可引发视黄酸相关孤儿核受体α和GATA结合蛋白3的mRNA、IL-5和IL-13表达水平的升高。可见，真菌抗原刺激鼻黏膜上皮细胞，使IL-25合成增加，进而上调视黄酸相关孤儿核受体α和GATA结合蛋白3 mRNA的表达，刺激活化固有淋巴样细胞2亚群，产生IL-13和IL-5，该过程可能参与AFRS的炎症反应。孤立化学感觉细胞是IL-25的主要来源，Patel等[28]研究发现，非侵袭性真菌性鼻窦炎患者炎症鼻黏膜中产IL-25孤立化学感觉细胞的富集程度高于自身非炎症鼻黏膜，且体外实验发现，真菌提取物可在72 h内使孤立化学感觉细胞内有丝分裂活性升高、IL-25合成增加。真菌抗原在早期诱导的固有免疫应答阶段即可刺激孤立性化学感觉细胞扩增并合成IL-25，进而促进IL-13和IL-5合成，影响紧密连接，上皮细胞通透性升高，黏膜固有免疫屏障暴露于更多真菌变应原，早期诱导的固有免疫应答得到增强。

FB鼻窦炎发病机制中涉及的固有免疫细胞和相关IL与AFRS不尽相同。Jiang等[12]发现FB鼻窦炎患者真菌球鼻窦组织匀浆IL-8、嗜酸粒细胞趋化因子、粒细胞集落刺激因子以及由活化的巨噬细胞产生的IL-1β水平显著高于健康对照组，表明FB鼻窦炎患者鼻黏膜存在巨噬细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞的激活和募集，提示FB患窦可能曾发生由巨噬细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞介导的固有免疫反应。但FB鼻窦炎患者真菌球鼻窦组织匀浆中来自Th2细胞、Treg细胞和Th17细胞的细胞因子(如γ干扰素、肿瘤坏死因子-α、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A)与健康对照组无显著差异。可见，FB发病机制中趋化因子的改变可能受上皮钙黏素减少引发真菌抗原增加的影响。

3.3.2Maspin Maspin具有促进细胞黏附细胞外基质，阻断烟曲霉提取物诱发呼吸道上皮细胞表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子介导免疫反应的作用。Maspin表达下降可能降低对真菌分泌的丝氨酸蛋白酶的抑制，丝氨酸蛋白酶破坏鼻黏膜顶端连接复合物的细胞黏附、基膜更易被穿透，促进真菌侵袭。IκB激酶(IκB kinase，IKK)α是调控核因子κB的关键蛋白。致病真菌引发固有免疫反应时，细胞因子可能诱导IKKα活化，从而结合并沉默Maspin启动子，导致Maspin表达下调[29]。

李琴和谢琼[30]对雄性大鼠FRS模型鼻黏膜Maspin mRNA表达的研究显示，FRS组、IFRS组大鼠Maspin mRNA和蛋白表达水平显著低于空白对照组、鼻塞组、免疫抑制剂组大鼠，而IKKα mRNA和蛋白表达水平与Maspin mRNA和蛋白表达水平相反，提示Maspin在FRS发病中起重要作用，故推测IKKα活化后下调Maspin表达可能引发FRS，且在IFRS侵袭机制中作用尤为显著，与张芳等[31]对大鼠呼吸道上皮细胞的研究结论一致。虞和伟等[29]分析检测FRS、IFRS和CRS患者病理标本Maspin表达水平的研究发现，Maspin在IFRS中的表达显著下调，在FRS中轻度下调，并活化IKKα，细化Maspin表达下降前FRS的发病机制，真菌模式分子结合TLR，激活核因子κB信号蛋白，致使多种炎症细胞因子释放，活化IKKα，但仍需进一步研究的验证。也有研究得出不同结论，张芳等[31]采用Western Blot杂交方法检测雌性大鼠动物模型Maspin、IKKα蛋白表达水平的研究发现，IKKα活化与Maspin表达下调无直接线性关系，表明在机体免疫功能正常时，IKKα活化并不会造成Maspin表达下调；而在免疫功能缺陷时，IKKα活化可促进Maspin表达下调，可能是Maspin表达下调并参与FRS发病机制的原因之一，但并不引起FRS真菌侵袭，故Maspin表达下调可能与IFRS致病真菌的侵袭性有关。

4 小 结

真菌定植是各分型FRS发病机制的始动环节，真菌定植后模式分子持续刺激PRR，活化固有免疫细胞合成大量固有免疫分子，破坏有免疫缺陷或潜在免疫缺陷个体和特应性个体鼻黏膜的顶端连接复合物，加剧真菌抗原暴露，引发固有免疫和适应性免疫失代偿。与CRS相比，FRS的发病率较低，但FRS的病因复杂，影响因素较多。目前，关于FRS发病机制的研究多为小样本回顾性研究，尚缺乏大样本前瞻性研究，且现有研究结果存在相互矛盾，尚无统一定论。关于黏膜固有免疫屏障在FRS发病中作用的大样本多中心研究将为明确FRS发病机制、推动FRS分子诊断和治疗的发展起到积极的作用。