外泌体在肾纤维化中的研究进展

赵胜，周向军，程帆

(武汉大学人民医院泌尿外科，武汉430000)

慢性肾脏病是对人类健康造成严重威胁的常见疾病，发病率呈持续上升趋势。肾纤维化是慢性肾脏病终末期不可逆的病理改变，是临床医务工作者面临的十分棘手的问题。针对肾纤维化虽然已经有大量的科学研究，但目前仍不能完全解释肾纤维化具体的发生、发展机制。1983年外泌体被首次发现[1]，截至目前已经证实多种类型的细胞均可分泌外泌体，包括血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、胚胎细胞甚至肿瘤细胞等[2-3]。起初，科研工作者认为外泌体仅仅是细胞处理胞内代谢产物的一种方式，并未给予足够重视，随着对外泌体研究的逐渐深入，人们发现外泌体发挥着非常重要的生物学功能。外泌体的功能与肾纤维化的发生及发展的关系值得进一步探究。近年来随着外泌体在肾脏病领域研究的迅速发展，临床以及基础的科学研究已经证实外泌体与肾脏纤维化密切相关[4]。现就外泌体的基本特点以及外泌体在肾脏纤维化中的研究进展予以综述。

1 外泌体概述

1.1外泌体的物质组成及功能 细胞外囊泡可以根据囊泡的大小、组成成分及生物学功能分为三大类，即细胞微粒、外泌体和凋亡小体[5]。其中外泌体是一类直径40～100 nm的细胞外囊泡，主要由脂质、蛋白质、核酸等构成。脂质构成了外泌体的膜，与细胞膜类似，富含胆固醇、鞘磷脂等，起到稳定外泌体结构的作用。外泌体内蛋白质成分包括CD63、CD9、Alix和TSG101等，这些蛋白被认为是鉴定外泌体相对特异性的标志物[6-8]。此外，特定细胞分泌的外泌体也可能含有特定的蛋白质，如肾小管上皮细胞分泌的外泌体含有CD24、集合管上皮细胞分泌的外泌体含有水通道蛋白2等[9-10]。外泌体内的核酸包括信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA)等，这些核酸物质抵达受体细胞后可以直接参与受体细胞某些基因蛋白质的编码或者干预某些基因蛋白的编码，从而改变相关基因的表达，发挥其特定的生物学作用[11-12]。

1.2外泌体的分泌以及与靶细胞的结合 外泌体来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，在生物体内广泛存在于尿液、血液等各种体液中[13]。被组织细胞释放的外泌体可以随着体液抵达受体细胞，并通过三种不同的机制与受体细胞结合而发挥作用：①外泌体膜表面特定蛋白与靶细胞膜表面特异性黏附分子及受体结合(无膜融合的发生)，活化受体及下游信号通路，从而达到信号转导的目的；②外泌体膜与受体细胞膜直接融合后，将外泌体内蛋白质及核酸物质等传递至靶细胞；③靶细胞通过内吞作用直接摄取外泌体，然后通过与胞内膜结构融合完成物质传递或者通过溶酶体进行降解[14]。

1.3外泌体的分离提取及鉴定 外泌体的分离纯化一直受到科研工作者的关注，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。由于提取外泌体的技术尚不成熟，各种方法各有优劣，所以尚无明确的最可靠的外泌体提取方法。目前比较常用的提取外泌体的方法主要包括：超速离心法，其最常用且获得的囊泡数量多，但操作耗时费力，对设备要求高，需要超速离心机[15]；密度梯度离心法，通过超速离心力的作用将外泌体富集于不同密度梯度的蔗糖溶液中，此法获得外泌体纯度很高，但产量较低，且步骤相对繁琐[16]；磁珠免疫法，用包被抗标志物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，将外泌体吸附并分离出来[17]。近年来，商业化试剂盒的推广成为外泌体分离的主流手段，试剂盒提取外泌体的方法操作简便，纯度可靠，但价格较昂贵。此外，还有超滤离心法、exoEasy亲和性膜离心柱法、多聚物沉淀法等多种外泌体提取方法，但实际应用较少[18]。外泌体鉴定方法主要有纳米颗粒跟踪分析技术、透射电子显微镜、动态光散射技术、共聚焦荧光显微镜技术以及蛋白质免疫印迹技术[19-20]，一般外泌体的鉴定至少需要同时使用2～3种方法。

2 外泌体与肾纤维化的关系

肾纤维化是多种慢性肾脏疾病进展到终末期的主要病理改变和共同通路，以肾间质过量细胞外基质积聚、肾脏组织结构破坏以及功能丧失为特征[21]。肾纤维化的具体病理机制为：在各种致病因素(炎症、创伤、代谢紊乱等)的作用下，基质蛋白的合成增加而降解减少，引起细胞外基质在肾实质内大量沉积，最终导致肾小球硬化、肾间质纤维化以及肾内血管硬化[22]。肾纤维化会导致肾功能丧失，最终引起慢性肾衰竭，因而深入研究肾纤维化的机制尤为重要。目前的研究发现，多种肾脏损伤因素(肾积水、缺血再灌注损伤、化疗药物等)或肾脏疾病(糖尿病、IgA肾病、狼疮性肾炎等)会导致纤维化的发生，其分子机制复杂，涉及炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等多方面，多种细胞信号分子及通路参与了肾纤维化的进程[23]。

外泌体是近年来研究的热点，其作为细胞间重要的通讯载体，能够介导细胞之间蛋白质、脂质和核酸等生物大分子的转运，广泛影响机体的病理生理过程。目前的研究发现，外泌体参与了包括肾纤维化在内的多种疾病的病理生理过程，同时在各种原因导致的肾纤维化中扮演着重要角色[24-25]。

2.1外泌体与肾积水导致的肾纤维化 在临床工作中，肾积水是导致肾纤维化最常见的原因之一[26]；另外，在科研工作中，单侧输尿管梗阻导致肾积水也是构建肾纤维化模型的重要方法[27]。首先，外泌体及其内容物在肾积水导致的肾纤维化的进展中发挥着重要作用。Furini等[28]采用蛋白质组学分析发现，在单侧输尿管结扎建立的小鼠肾纤维化模型中，肾组织中谷氨酰胺转移酶-2(transglutaminase-2，TG2)蛋白的表达量显著升高，而剔除TG2基因后，小鼠肾纤维化程度明显减轻；后续的细胞实验研究发现，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以刺激肾小管上皮细胞分泌富含TG2蛋白的外泌体，而应用外泌体分泌抑制剂GW4869可显著抑制细胞上清中TG2的含量，该研究结果证明，TG2通过外泌体被肾小管上皮细胞分泌至胞外，从而发挥促纤维化作用。Borges等[29]的研究发现，积水肾脏皮质富含外泌体，该外泌体内富含TGF-β1蛋白对应的信使RNA，然后该外泌体被靶细胞摄取，从而促进肾纤维化的进展。以上研究证明，肾小管上皮细胞可分泌具有生物学功能的蛋白质或信使RNA的外泌体，并靶向作用于受体细胞，从而引起纤维化的发生。

此外，外泌体内另一重要成分miRNA，也可能在积水所致肾纤维化中发挥作用。Zhou等[30]的研究发现，促纤维化因子TGF-β1可刺激肾小管上皮细胞分泌富含miR-21的外泌体，该外泌体可刺激正常肾小管上皮细胞上皮间质转化，并通过蛋白激酶B/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白信号通路，促进肾纤维化的进展。以上新的研究加深了科研工作者对积水导致肾纤维化分子机制的认识。其次，外泌体除了在积水导致肾脏纤维化的进程中发挥作用外，某些细胞在特定情况下产生的外泌体在积水肾纤维化中也起着重要的治疗作用。在一项针对肾纤维化分子治疗的研究中，Wang等[31]首先利用基因工程技术过表达间充质干细胞分泌的外泌体中运载的miR-let7c，然后将产生的外泌体通过静脉注射入单侧输尿管梗阻模型小鼠体内，结果发现，小鼠肾脏纤维化程度较单纯的输尿管梗阻动物模型明显减轻，说明外泌体在积水肾纤维化中发挥治疗作用，为肾积水导致的肾纤维化的预防和治疗提供了新的思路。总之，肾积水是导致肾纤维化的重要原因之一，外泌体参与了肾积水导致的肾纤维化的发生、发展过程，并且在肾积水导致的肾纤维化的预防和治疗中有一定的应用前景。

2.2外泌体与肾缺血再灌注损伤导致的肾纤维化 肾缺血再灌注损伤是泌尿外科临床工作者经常面临的问题，多种手术方式(肾部分切除术、肾移植术等)均会不可避免地造成肾缺血再灌注损伤。目前的研究证明，急性肾缺血再灌注损伤最终会导致肾纤维化的发生，其机制复杂，涉及炎症、氧化应激、凋亡等多方面[32]。在一项动物研究中，Cruzado等[33]通过夹闭大鼠单侧肾蒂60 min建立了单侧肾缺血再灌注损伤模型，16周后发现，实验组大鼠肾脏发生肾小球硬化以及肾间质纤维化。目前有研究发现，外泌体与肾缺血再灌注损伤的关系密切，然而绝大多数研究是致力于外泌体在肾脏缺血再灌注损伤中发挥的保护作用[34]。Dominguez等[35]研究发现，正常肾小管上皮细胞来源的外泌体能够有效减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤，并促进损伤后的修复。Lin等[36]的研究发现，间充质干细胞来源的外泌体能够有效保护肾脏，减少缺血再灌注造成的损伤。研究发现，骨髓间充质干细胞可分泌大量富含miR-199a-5p的外泌体，并靶向作用于BIP(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells)基因，抑制内质网应激，从而在早期减轻肾缺血再灌注损伤[37]。除保护作用外，外泌体在肾缺血再灌注损伤的早期诊断以及预后评估方面也发挥着重要作用。有研究发现，尿液中外泌体内水通道蛋白1有望成为早期诊断肾缺血再灌注损伤的标志物[38-39]。

目前虽然已经有大量证据表明肾缺血再灌注损伤与外泌体密切相关，而且缺血再灌注损伤最终也可以导致肾纤维化的发生，但是仅有少数研究直接阐述了外泌体与缺血再灌注导致的肾纤维化的关系，可能与缺血再灌注损伤引起肾纤维化的模型周期相对较长有关。有研究报道，缺氧可刺激肾小管上皮细胞分泌富含TGF-β1蛋白信使RNA的外泌体，从中提取到的外泌体可有效刺激成纤维细胞的增殖，从而发挥促进纤维化进展的作用[29]。另有研究发现，脂肪间充质干细胞分泌的外泌体可以激活肾小管上皮细胞Sox9(SRY related high mobility group box gene 9)基因的表达，从而延缓缺血再灌注损伤后急性肾损伤向肾间质纤维化进展的过程[40]。这些研究可以深化人们对肾缺血再灌注损伤导致肾纤维化机制的理解。总之，肾缺血再灌注损伤最终可导致肾纤维化的发生，并可引起组织细胞分泌外泌体的改变，不同细胞来源的外泌体也可在一定程度上影响肾组织缺血再灌注损伤的程度，但具体机制尚需更多研究证实。

2.3外泌体与糖尿病导致的肾纤维化 糖尿病肾病作为慢性肾脏病的一种，是糖尿病患者最重要的合并症之一[41-42]。此类患者一旦发生肾损害，将出现持续性蛋白尿、肾功能的持续性减退直至肾衰竭。然而，糖尿病肾病的早期诊断尚缺乏可靠的标志物。近年来研究发现，体液中的外泌体，尤其是尿液中外泌体的检测可以作为早期诊断糖尿病肾病的重要方法,在糖尿病大鼠模型中，尿液中的外泌体内有两种蛋白的表达较正常尿液有显著改变，其中脯氨酰氨基酸(二肽)酶表达显著升高，而MUP-1(major urinary protein 1)表达显著降低[43]。此外，Zubiri等[44]进一步研究了糖尿病肾病患者与正常人尿液外泌体中352种蛋白的表达发现，AMBP(alpha-1-microglobulin/bikunin precursor)、KMT2C(lysine N-methyltransferase 2C)以及VDAC1(voltage-dependent anion-selective channel protein 1)的表达差异显著。

除外泌体内的蛋白质外，外泌体中miRNA的表达量也有望成为糖尿病肾病早期诊断的重要部分。Barutta等[45]检测了微量蛋白尿患者与正常人尿液外泌体中22种miRNA的表达，其中miR-130a和 miR-145在微量蛋白尿患者尿液外泌体中表达显著升高，而miR-155和miR-424表达显著降低；在糖尿病模型动物的尿液外泌体中，miR-145的表达呈现出与之类似趋势，除动物模型外，体外培养的肾小球系膜细胞在高糖环境下也可分泌大量含miR-145的外泌体，因而研究者提出，外泌体中miR-145的含量与糖尿病肾病密切相关，因此糖尿病患者尿液中外泌体内的成分分析有望成为糖尿病肾损害早期诊断的新策略。

除诊断作用外，外泌体也参与了糖尿病患者肾脏纤维化的发生及发展。肾小球硬化是糖尿病肾病进展至终末期的重要病理改变，肾小球内皮细胞、系膜细胞以及足细胞作为肾小球主要的构成部分，它们之间的信号交流可能发挥了重要作用。研究发现，高糖可刺激肾小球内皮细胞分泌外泌体，这些外泌体内部含有TGF-β1的信使RNA，可被肾小球系膜细胞以及足细胞摄取，促进细胞发生上皮间质转化，从而引起细胞功能紊乱[46-47]。此外，传统中药通心络可有效抑制肾小球上皮细胞外泌体的分泌，降低纤维化的发生，这可能是通心络治疗糖尿病的重要机制之一[48]。外泌体在糖尿病肾脏纤维化的治疗中也发挥重要作用。Jiang等[49]提取了尿源干细胞分泌的外泌体，并通过尾静脉注射入糖尿病小鼠体内，结果发现，与对照组相比，实验组小鼠蛋白尿减少，肾小管上皮细胞及足细胞凋亡减少，而肾小球内皮细胞增殖力升高。另有研究发现，间充质干细胞分泌的外泌体可通过调节自噬改善糖尿病大鼠肾脏纤维化程度[50]。以上研究表明，外源性外泌体在糖尿病肾病的治疗中有一定的应用潜能。

2.4外泌体与其他原因导致的肾纤维化 IgA肾病是一种免疫失调、免疫复合物介导的原发性肾小球疾病，是中青年人群最常见的原发性肾小球疾病；狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮合并的免疫性肾损伤，以上两种疾病最终都可以导致肾脏纤维化的发生。然而，目前此类患者的临床诊断仍依赖于肾活检，因而不可避免地会对患者造成较大损伤。Min等[51]的研究发现，IgA肾病患者相较正常者，尿液中外泌体内的miR-215-5p和miR-378i表达显著升高，而miR-29c和miR-205-5p表达显著降低。Solé等[52]的研究发现，miR-29c在狼疮性肾炎患者尿液中外泌体内的含量较健康对照者显著升高。因而，外泌体内这些指标的变化为此类患者的无创诊断提供了新的思路。

高血压肾病作为慢性肾脏病的病因之一，最终也会引起肾脏广泛纤维化。一项针对高血压肾病的研究发现，缺氧刺激人体心肌细胞产生的外泌体可有效改善高血压大鼠模型肾脏炎症反应及组织纤维化的程度[53]，表明外泌体在高血压导致的肾纤维化中的治疗潜能。肾积水、缺血再灌注损伤以及糖尿病是导致肾纤维化最重要的原因，所以对于其他原因导致的肾纤维化的研究相对较少，有关外泌体的研究更少，仅有的一些研究仅仅局限于外泌体在其中发挥的诊断作用，对于机制的相关研究尚待探索。

3 小 结

外泌体是目前科学研究的热点，多种病因导致的肾脏纤维化与外泌体密切相关。首先，外泌体内的多种成分(如蛋白质、miRNA等)可作为肾脏纤维化的诊断标志物，也是目前研究较多的领域；其次，不同的组织细胞产生的外泌体可通过不同的机制影响肾纤维化的发生、发展；最后，多种干细胞来源的外泌体内不同的有效成分可一定程度上对肾纤维化起到治疗作用。目前，关于外泌体与肾纤维化关系的研究仍处于初级阶段，外泌体从细胞中释放的具体过程、机制、作用于受体细胞的方式以及引起纤维化改变的具体靶点等仍未明确。针对以上各方面的研究可以深化人们对外泌体以及肾纤维化的认识，并有助于在肾纤维化的治疗中获得新的发现。