环状RNA在头颈部肿瘤中的研究进展

杨丽可,孙亚男

(哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，哈尔滨 150001)

头颈部肿瘤是人类常见的肿瘤之一，其发病率在所有肿瘤中居第六位。头颈部肿瘤会降低患者生活质量，并产生巨大的社会负担，吸烟、饮酒和人乳头瘤病毒感染，是最常见的危险因素。近5年，尽管肿瘤的治疗方面取得了一定进展，但头颈部肿瘤患者的生存率仍为50%，许多头颈部肿瘤患者在诊断时肿瘤已转移，但目前没有可用于监测早期头颈部肿瘤患者局部复发或远处转移的工具[1-2]。因此，寻找可以识别患者肿瘤发生、发展、转移的生物标志物尤为重要。多种类型的RNA，包括长链非编码RNA、环状RNA(circular RNA，circRNA)和微RNA(microRNA，miRNA)参与调节哺乳动物细胞中各信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达水平可为新型肿瘤标志物的研究提供新的角度[3]。研究表明，几种circRNA通过miRNA或蛋白质参与调节糖类、脂质及氨基酸的代谢，说明circRNA是非编码RNA调控网络的一部分[4]。现通过总结与头颈部肿瘤相关的人类circRNA文献，探讨近年国内外关于circRNA与肿瘤增殖、侵袭等的关系，对circRNA的结构、特征、作用、发生机制及与头颈部肿瘤治疗方向的潜在价值等予以综述。

1 circRNA的结构、特征、作用及发生机制

1.1circRNA的结构及特征 circRNA由单个RNA分子末端共价形成，无5′及3′核糖核苷酸末端结构，细胞中circRNA丰富、保守、稳定，并且表具有时空特异性。

1.1.1丰富性 随着科技的进步与观念的更新，人类通过基因组学找到了更多关于circRNA存在的证据。Salzman等[5]鉴定了2 000例人类、1 900例老鼠以及700例线虫的circRNA测序资料，证实了50种circRNA的存在，发现大多数正常细胞与肿瘤细胞中均有circRNA表达。Jeck和Sharpless[6]发现大约1/8的表达基因可产生circRNA，而且环状分子的丰度是相关线性mRNA的10倍以上。Memczak等[3]也在大量研究中发现，不同细胞类型和发育阶段也存在大量circRNA特异性表达。因此，circRNA的研究有据可循。

1.1.2高度保守性 内含子形成的circRNA通过2′,5′-磷酸二酯键连接首尾两端，而外显子形成的circRNA则通过3′,5′-磷酸二酯键首尾相连接，说明特殊的反向剪接具有高度的保守性。研究发现，人类成纤维细胞中的457circRNA可与小鼠的circRNA匹配，相同的circRNA可表达于脑、睾丸、胃、肝、肾，甚至大多数circRNA横贯了真核生物的一生，circRNA在真核基因中表现出古老、保守的特性，因此在不断变化的分子生物学研究中，这一特性成了一个标杆[7-9]。

1.1.3稳定性 circRNA在细胞质中可以抵抗脱支酶和RNA核酸外切酶降解，因而可以稳定存在于细胞质中，使研究过程更加平稳有序、降低了探索过程中的不确定性、提高了得出实验结果的可能[5]。

1.1.4时空特异性 circRNA在同一生物的不同发育阶段、同一发育阶段的不同部位均表现出表达差异性[3,5,10]。这样的差异丰富了生物多样性，揭示了分子生物学的研究中生物机体运转的高效性。

1.2circRNA的作用 circRNA的生物作用包括5个方面：海绵效应、转录后调节、环形翻译、circRNA介导的拟基因以及干扰剪接，circRNA的位置、结合位点、表达方式不同[11]。①海绵效应：circRNA的超级海绵被认为是一种新的竞争性内源RNA，可通过互补碱基配对海绵化并抑制相关miRNA。②转录后调节：转录后调控细胞核中大多数circRNA(由内含子形成)位点几乎没有miRNA结合功能，但敲低circRNA会阻碍相应基因的转录[12]。③环形翻译：如果circRNA包含直接与核糖体结合的内部核糖体进入位点序列，则已证明可以在真核细胞中翻译[13-15]。④circRNA介导的拟基因：在研究circRNA的过程中，应注意circRNA衍生的拟基因对实验结果的干扰，circRNA衍生的拟基因暗示了circRNA通过逆转转座对宿主基因组的影响[11]。⑤干扰剪接：环化过程影响选择性剪接circRNA通常被认为是源自蛋白质编码基因剪接过程的独特功能性副产物，目前鉴定出的大部分circRNA由外显子衍生，因此此类circRNA的形成过程可能会影响相关前体mRNA的选择性剪接，从而导致基因表达改变。

1.3circRNA的发生机制 circRNA不同于线性RNA的剪接，包括外显子套索环化和内含子配对环化[16]。

1.3.1circRNA的外显子套索环化 外显子套索环化的形成机制为直接反向剪接和外显子跳读[17]。直接反向剪接是通过外显子上游的5′头与外显子下游的3′尾配对，外显子环化形成circRNA，外显子跳读是指内含子跳读形成的套索，随着包含相应的外显子套索内部的拼接，多余的内含子被切除形成circRNA。

1.3.2circRNA的内含子配对环化 内含子有3种不同的剪接方式：自我剪接、酶促剪接以及核mRNA前体剪接。这3种剪接方式均为前体mRNA中的2个内含子通过碱基互补配对形成套索，再切除内含子，然后形成circRNA。

2 circRNA与肿瘤的关系

2.1circRNA与鼻腔鼻窦恶性肿瘤 虽然鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，但在各种解剖学亚位点的相对发病率各不相同。相对于头颈部其他部位的鳞状细胞癌百分比(65%～70%)，鼻腔鼻窦的鳞状细胞癌占比相对较小，仅占头颈部鳞状细胞癌的3%～5%[18]。鼻腔鼻窦鳞状细胞癌具有高度恶性，加之位置隐蔽、早期症状不明显，在临床中往往预后不良。鼻腔鼻窦恶性肿瘤病理类型主要包括嗅神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、腺癌、未分化癌、神经内分泌癌、恶性黑色素瘤、腺样囊性癌、血管周细胞瘤、淋巴瘤和软组织肉瘤等[19]。上颌窦肿瘤早期症状不明显，发现时往往已经引起一定程度的破坏，如已经侵犯窦腔的骨质或周围组织，当这种肿瘤被局限于窦腔时，远处转移并不常见，但当侵犯面部、面部皮肤、翼腭窝、口周丰富的软组织时，转移到局部或远处淋巴结的情况比较常见。上颌窦肿瘤的治疗多采取手术治疗、放疗和化疗，没有分子水平上的治疗，且现有研究并没有发现与鼻腔鼻窦恶性肿瘤相关的具体circRNA，也没有确切提出功能及作用，因此寻找相关的circRNA尤其重要。

2.2circRNA在鼻咽癌的发展和侵袭中的作用 鼻咽癌是与EB病毒相关的头颈部肿瘤，具有种族差异和地域分布差异，主要发生于东亚、东南亚及北非国家[20]。而在中国，鼻咽癌是中国南方地区最常见的头颈部恶性上皮肿瘤，是严重影响人类生活质量的一种恶性肿瘤[21-22]。鼻咽癌的传统治疗大多以放疗为主联合化疗及靶向治疗，但术后复发率较高，并会出现放疗后出血等一系列并发症，且患者5年生存率为70%[23]。Wei等[24]通过反转录-定量聚合酶链反应和荧光素酶报告实验评估circ_0008450的机制，结果显示circ_0008450在鼻咽癌组织和细胞中升高，沉默的circ_0008450可以抑制细胞增殖和转移的特性并增加凋亡细胞数量，异位表达circ_0008450加强了恶性生物学行为，且circ_0008450减少了miR-577介导的趋化因子配体9抑制，促进了鼻咽癌的发生。总之，circ_0008450通过调节miR-577/趋化因子配体9信号转导在鼻咽癌细胞中充当致癌基因。Zhu等[25]研究表明，高表达的circ-ZNF609吸附miR-150-5p上调特异性β1糖蛋白表达，从而促进鼻咽癌细胞的增殖和转移能力。Shuai等[26]进行实时定量荧光聚合酶链反应以测定鼻咽癌和邻近组织中circRNA_100783、circRNA_0000285和circRNA_100782的水平，并在鼻咽癌患者和健康对照人群的血清样品中进一步证实了circRNA_0000285水平，研究显示与健康对照组的邻近组织和血清样品相比，鼻咽癌患者的肿瘤组织和血清样品中circRNA_0000285显著增加。因此，circRNA_0000285可能是鼻咽癌一种新的生物标志物，参与鼻咽癌的放射敏感性。Chen等[27]研究发现，与邻近组织相比，在鼻咽癌组织中circRNA_000543表达上调，且放射抗性样品中的表达量较放射敏感性鼻咽癌组织样品中更高，与低 circRNA_000543患者相比，高circRNA_000543表达鼻咽癌患者的总体生存率较差，进一步研究表明，circRNA_000543通过靶向miR-9/血小板衍生生长因子受体B轴沉默circRNA_000543，提高鼻咽癌细胞对辐射的敏感性，说明circRNA_000543可能是鼻咽癌抗辐射的潜在靶标。以上相关标志物高表达时均有强烈的致癌倾向，有助于新的肿瘤标志物的选择。

2.3circRNA与口腔癌的发展和侵袭中的作用 口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是头颈部最常见、危害最严重的恶性肿瘤之一。口腔癌是一种多因素肿瘤，缺乏有效和准确的治疗、诊断工具，因此需要寻找用于及时检测和患者分层的可靠生物标志物。circRNA是各种癌症的生理和病理过程中的关键因素，也反映了口腔癌的发展和进展。

2.3.1circRNA在口腔癌细胞及组织中的表达 Li等[28]研究表明，has_circ_0008309在45组口腔癌样本中显著下调，并且在病理变异上有相关性。除此之外，Su等[29]发现，与成对的非癌症匹配组织相比，OSCC组织中hsa_circ_0005379的表达显著降低，并且与肿瘤大小和分化相关。hsa_circ_0005379的过表达有效抑制了体外OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖，并抑制了体内裸鼠OSCC的生长，研究表明，hsa_circ_0005379可能参与表皮生长因子受体通路的调控，此外，研究还发现hsa_circ_0005379的高表达可以显著增强OSCC对西妥昔单抗药物的敏感性。Ouyang等[30]经过实验发现，has_circ_0109291在OSCC组织与其他细胞系的组织相比有明显提高，并且高表达的has_circ_0109291往往预后更差，这说明此RNA可能成为OCSS治疗的新靶点。另有研究显示hsa_circ_001242在OSCC中表达下降，并且可以作为诊断和治疗OSCC的潜在新型生物标志物[31]。Zhao等[32]通过大量临床样本发现，与健康对照人群的唾液相比，OSCC患者的唾液中有12种上调和20种下调circRNA，在差异表达的circRNA中，hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971和hsa_circ_0008068上调，与健康组相比，OSCC组hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632和hsa_circ_0008792下调，这是第一项证明唾液hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971作为诊断OSCC的生物标志物的潜力的研究。在OSCC的circRNA的研究中，上调下调的circRNA均有体现，因此规范肿瘤标志物的类型及探索方向的调整尤为重要。

2.3.2circRNA与口腔癌相关机制 hsa_circ_0007059可通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路改变细胞生长，是OSCC潜在的预后(或治疗)靶点[33]。Chen等[34]研究表明，沉默circRNA_100290可显著降低细胞增殖速度，抑制细胞迁移和侵袭能力，但会促进细胞凋亡。在口腔癌中，circRNA_100290在miR-29家族中发挥海绵作用。circRNA_100290可充当内源竞争RNA以抵消miR-378a介导的葡萄糖转运子1抑制，从而促进OSCC中的糖酵解和细胞增殖[35]。上述研究表明circRNA在口腔癌的发生发展中起到了重要的作用，提示了口腔癌复杂的机制，参与了癌症不同表型，如增殖、凋亡、侵袭等。

2.4circRNA与喉癌发展及侵袭中的作用 喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，治疗包括手术治疗、放疗及化疗，但患者5年生存率仍然不尽如人意。circRNA研究中，Fan等[36]研究表明，LSCC组织中hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529显著上调，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529最可能潜在的靶miRNA分别为hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p，功能分析显示，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529参与了胶原蛋白的合成过程。Wu等[37]认为，circRNA hg19_circ_0005033可促进喉癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗耐药。Tian等[38]研究发现，circRASSF2在LSCC组织和LSCC细胞系中与成对的相邻非肿瘤组织和正常细胞相比显著上调。此外，敲除circRASSF2可显著抑制体外细胞增殖和迁移，miR-302b-3p抑制剂可阻断细胞增殖和迁移。综上，通过与miR-302b-3p相互作用并减少抑制素样生长因子1受体表达，可使circRASSF2沉默抑制LSCC的进展。

目前并没有明确、可应用于临床的新型标志物，也没有能够体现肿瘤发展的不同阶段的测试方法，在拥有先进医疗保健系统的国家，喉癌的病死率正在下降，但相关并发症如咳嗽、声音嘶哑、吞咽困难和呼吸困难，仍然给患者带来巨大痛苦。因此，阐明重要的分子发病机制将对潜在的喉癌具有重要意义。

3 circRNA是潜在的头颈部肿瘤的靶点

circRNA活跃于人体细胞生长发育的许多信号通路中。circRNA对上皮-间充质转化调节起到了重要作用，而肿瘤的转移则与上皮-间充质转化具有极大的相关性。在上皮-间充质转化的过程中，上皮细胞失去特征，例如细胞间黏附和细胞极性的丧失，细胞获得运动性，并且迁移病情，如成为间质干细胞。实验表明，circRNA与肿瘤的转移与患者的预后密切相关，且证明了转化生长因子-β/Smad途径是各种癌症类型的生长和转移中的正调节剂[39]。因此，肿瘤细胞的转移可以通过检测癌旁组织中的circRNA的变化预测和鉴别。目前的分析表明，circRNA的高表达与人类癌症的临床病理和预后之间存在明显关联，有希望成为癌症的生物标志物和治疗靶标[40]。尽管如此，仍需更多采用标准化方法的大规模研究为circRNA的预后价值提供新的见解。

circRNA也有一些诊断的缺点。首先，一些circRNA的存在需要患者的病理组织进行鉴别与诊断，属于有创操作，增加了感染与转移的风险。其次，检测组织或外泌体中circRNA的临床及常规实验室检查较昂贵，限制了生物标志物circRNA的临床应用。circRNA进行诊断的可靠性仍然需要大量的实验与临床试验结果及病例证明。此外，由于大量的circRNA，它们的功能复杂并且不同。目前的研究主要集中在RNA与蛋白质之间的关系，但circRNA二级结构的功能及其在DNA基因组中的作用仍然需不断探索。

4 小 结

circRNA是近年来基因遗传学的重大发现，为肿瘤的发生、发展、治疗与预防提供了新的研究思路，并且circRNA的高度组织特异性及稳定性使其具备了作为新型生物标志物的条件。大量研究结果表明circRNA在肿瘤中显著表达，并且许多途径可以影响肿瘤的发展。虽然已有许多研究证实了circRNA在生理和病理过程方面的生物学功能，以及circRNA在喉癌中扮演癌基因的功能，但是具体机制需要在今后的研究中进一步揭示。然而，circRNA能否真正作为一个喉癌的分子标志物，还需要更多大样本的实验证实，并且仍有很多的未知领域需要探索以及辨证，以便应用于临床。