布氏菌病活疫苗（Rev.1株）冻干保护剂工艺的研究

布氏菌病是在全球范围内广泛流行的重大人畜共患病。该病不仅严重影响着畜牧养殖业的健康、稳定发展，更是给公共卫生、食品安全等领域带来巨大危害，对人类健康也造成了严重威胁。在布氏菌病流行地区从业畜牧养殖及兽医工作者感染该病现象非常普遍，受到了业内高度关注。

国内广泛使用的布氏菌病疫苗主要为布氏菌活疫苗（S2株）。该疫苗虽然在国内生产和使用数十年，在布氏菌病防控中发挥了一定的作用，但实践证明，其防控效果是有限的，难以达到有效控制或消灭布氏菌病的效果。目前国际上普遍推荐布病活疫苗（Rev.1株），该疫苗在欧洲、美洲地区多个国家使用多年，其稳定性、安全性及保护性等性能指标已得到广泛认可，并在多个国家应用后根除了该病，取得了巨大成效。因此我公司积极研制该疫苗，以期早日进入市场，为布病防控做出贡献。

1 材料

1.1 菌液 布鲁氏菌Rev.1株菌液，批号分别为：SY001批，SY002批，SY003批；3批发酵菌液的菌数分别为：14.4×109CFU/mL、15.5×109CFU/mL、15.1×109CFU/mL；由金宇保灵生物药品有限公司提供。

1.2 试剂 蔗糖，购自津市科盟化工工贸有限公司，批号20140521；明胶，购自北京奥博星生物技术有限公司，批号20150116；脱脂奶粉，购自新西兰，批号2014001；硫脲，购自津市科盟化工工贸有限公司，批号20140924；氢氧化钠，购自津市北联精细化学品开发有限公司，批号20150120。

1.3 稀释液 灭菌生理盐水稀释液200mL，批号5329001，由金宇保灵生物药品有限公司提供。

1.4 设备 冻干机、灌装系统、电子平、酸度计、储液桶等。

2 方法

2.1 冻干保护剂的制备

2.1.1 蔗糖脱脂乳保护剂的制备 分别称取蔗糖75g和135g脱脂奶粉加入到盛放有1200mL注射用水的10L储液桶中，持续搅拌待其充分溶解后用注射用水定容至1500mL，用硫酸纸、牛皮纸包扎储液桶瓶口，以118℃、30min高压灭菌后待用；每批制备3桶蔗糖脱脂乳保护剂，共计制备3批。

2.1.2 含硫脲的蔗糖明胶保护剂的制备 分别称取蔗糖300g、75g硫脲加入到盛放有1000mL注射用水的10L储液桶中，持续搅拌使其彻底溶解；称取150g明胶，用电磁炉加热溶解明胶后再倒入储液桶中用注射用水定容至1500mL混合均匀，用2%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用硫酸纸、牛皮纸包扎储液桶瓶口，以121℃、1.5h高压灭菌后待用；每批制备3桶含硫脲的蔗糖明胶保护剂，共计制备3批。

2.1.3 蔗糖明胶保护剂的制备 称取蔗糖300g加入到盛放有1000mL注射用水的10L储液桶中，持续搅拌使其彻底溶解；称取150g明胶用电磁炉加热溶解明胶后再倒入储液桶中用注射用水定容至1500mL混合均匀，用2%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用硫酸纸、牛皮纸包扎储液桶瓶口，以121℃、1.5h高压灭菌后待用；每批制备3桶明胶蔗糖保护剂，共计制备3批。

2.2 冻干活疫苗的制备

2.2.1 蔗糖脱脂乳冻干活疫苗制备 分别采取上述3批菌液与蔗糖脱脂乳保护剂，以菌液与保护剂配比为6∶1，将定量的菌液无菌转入储液桶内混合均匀，以4ml/瓶分装，经冷冻真空干燥后制成冻干活疫苗。

2.2.2 含硫脲的蔗糖明胶保护剂冻干活疫苗制备 分别采取上述3批菌液与蔗糖脱脂乳保护剂，以菌液与保护剂配比为6∶1，将定量的菌液无菌转入储液桶内混合均匀，以4mL/瓶分装，经冷冻真空干燥后制成冻干活疫苗。

2.2.3 蔗糖明胶保护剂冻干活疫苗制备 分别采取上述3批菌液与蔗糖脱脂乳保护剂，以菌液与保护剂配比为6:1，将定量的菌液无菌转入储液桶内混合均匀，以4mL/瓶分装，经冷冻真空干燥后制成冻干活疫苗。

2.2.4 每批采用相同批号的菌液分装数量相同的不同配方保护剂，采用相同的冻干曲线重复实验3批。冻干曲线见图1。

图1 冻干曲线

2.3 物理性状 观察不同配方保护剂各批次冻干活疫苗的外观及颜色，加稀释液后是否迅速溶解。

2.4 活菌计数 将不同配方保护剂各批次冻干活疫苗分别用灭菌生理稀释溶解至4mL，按照现行《中国兽药典》附录进行活菌计数。

3 结果

3.1 性状 不同配方保护剂各批次冻干活疫苗均为淡黄色疏松团块，易与瓶壁分离，加入稀释液后迅速溶解，符合要求。详见表1～3。

3.2 活菌计数 不同配方保护剂各批次冻干活疫苗，冻干后活菌含量差异不明显，冻干前后活菌数损失比例均小于5%。详见表4～6。

表1 SY001批冻干活疫苗物理性状检验结果

表2 SY002批冻干活疫苗物理性状检验结果

表3 SY003批冻干活疫苗物理性状检验结果

表4 SY001批不同配方保护剂冻干活疫苗冻干后的活菌含量

表5 SY002批不同配方保护剂冻干活疫苗冻干后的活菌含量

表6 SY003批不同配方保护剂冻干活疫苗冻干后的活菌含量

4 结论

采用我公司成熟的布氏菌病活疫苗（S2株）冻干曲线冻干布氏菌病活疫苗（Rev.1株），三种不同配方的冻干保护剂对疫苗的冻干效果影响不明显，但蔗糖明胶保护剂冻干后，活菌含量略高于蔗糖脱脂乳；而冻干时加入适量的硫脲，则可以在一定程度上增加疫苗的耐热性。因此，综合冻干前后活菌数损失量、疫苗的粘稠度对灌装设备和冻干效果的影响、活菌计数误差等各项因素，我们选择蔗糖明胶保护剂，加入终浓度为1%硫脲的工艺作为布氏菌病活疫苗（Rev.1株）大规模生产的冻干工艺，即选用20%蔗糖、10%明胶冻干保护剂，与菌液以1∶6的配比比例混合，再加入终浓度约为1%的硫脲制备布氏菌病活疫苗（Rev.1株）。