新型冠状病毒引起的临床相关疾病及其分子生物学检测

郭雅琼，张 笠，鲁 彦

1.西北民族大学直属附属医院/甘肃省第二人民医院检验科，甘肃兰州 730000；2.中国人民解放军96604部队医院检验科，甘肃兰州 730000

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)潜伏期长，传染性强，发病机制不明确，在临床上极易引起呼吸困难、脓毒血症、凝血功能障碍、急性呼吸窘迫综合征等，同时还可引起心血管系统疾病等一系列合并症状，且尚无特效治疗药物[1]。由于SARS-CoV-2引起的疫情发展迅速，对于出现临床症状及疑似患者进行及时、准确的SARS-CoV-2核酸检测及诊断显得尤为重要。本文就SARS-CoV-2的基因结构特点、分子生物学检测及其引起的相关临床疾病进行了简要介绍，以期为临床诊断提供一定的参考依据。

1 冠状病毒

冠状病毒是目前已知最大的RNA病毒，其基因组是一种具有薄膜的单股正链RNA，具有典型的5′端帽结构和3′端Poly(A)尾，属于巢状病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科，该亚科包括4个属:α、β、γ和δ冠状病毒[2]。因其在电镜下的形状似皇冠，故命名为冠状病毒。冠状病毒感染可影响呼吸系统、消化系统和神经系统等，同时还可感染动物导致动物患病[3]。迄今为止，共发现7种冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2)可感染人类[1,4]。其中HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病毒[5]。

2 SARS-CoV-2

2.1SARS-CoV-2的基因结构特征 SARS-CoV-2是一种具有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形的病毒，属于β冠状病毒属[1，6]。SARS-CoV-2基因在同一条编码链上有5个典型的开放读码框架(ORF)，包括开放读码框架1ab多蛋白(ORF1ab，7096-aa)、刺突糖蛋白(S,1273-aa)、包膜蛋白(E，75-aa)、膜蛋白(222-aa)和核衣壳蛋白(N，419-aa)[7]。目前对于SARS-CoV-2核酸检测主要针对ORF1ab、N基因、E基因这3个位点。研究表明，SARS-CoV-2基因组与2003年爆发的SARS-CoV基因组序列相似度达80%，与蝙蝠SARS-CoV ZC45具有更高的同源性(88%)[8-9]。

2.2SARS-CoV-2的理化特性 SARS-CoV-2对紫外线和热敏感，56 ℃存活 30 min、75%乙醇、含氯消毒剂、乙醚、过氧乙酸、氯仿和紫外线等对该病毒均可有效灭活，氯己定灭活效果不佳[10]。此外有报道显示室温(22～25 ℃，湿度 40%～50%)下，SARS-CoV-2可存活5 d[11-13]。以上认识多来自对SARS-CoV和MERS-CoV的研究。

2.3SARS-CoV-2的流行病学特点 研究显示，武汉早期确诊的SARS-CoV-2感染患者有武汉市华南海鲜市场暴露史(68.3%)[4]。随后发现部分SARS-CoV-2感染患者具有武汉旅居史及直接或间接接触史,提示了人与人之间传播的可能[11]。目前SARS-CoV-2感染出现家庭聚集性发病，同时出现部分医务人员感染，主要以飞沫及接触等方式在人群中传播，少数经气溶胶与消化道传播。

3 SARS-CoV-2与临床疾病

3.1SARS-CoV-2与呼吸系统疾病 研究发现，SARS-CoV-2主要通过皮肤黏膜、眼结膜等感染人体，侵入人体后，多侵犯人体呼吸道肺泡上皮细胞等[4，6]。体外分离培养研究显示，SARS-CoV-2感染后至被检出存在一定的窗口期，在人呼吸道上皮细胞内发现约需96 h，而在VeroE6和Huh-7细胞系中需要6 d。ZHU等[6]通过对原因不明的严重肺炎患者的3份支气管肺泡灌洗液标本进行病毒基因组学研究，利用下一代测序、实时反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞培养和电子显微镜在临床标本中首次检测到了SARS-CoV-2。由此证实SARS-CoV-2感染人体后会引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。

COVID-19发病年龄集中在40～60岁，以男性、有基础疾病者居多，也有儿童发病。临床症状主要为发热、干咳、乏力等，并逐渐出现气短、呼吸困难，病情严重者可迅速发展成急性呼吸窘迫综合征、脓毒症等多脏器功能衰竭，甚至死亡。有研究报道血管紧张素转换酶2(ACE2)在人体不同器官组织中表达水平并不相同，以肺泡和小肠上皮细胞表达水平尤为显著[14]。XU等[1]通过研究认为COVID-19的发病机制很可能是SARS-CoV-2感染人体后与呼吸道和肺组织中的ACE2受体结合后导致的一系列信号级联反应。刘映霞等[15]通过研究发现SARS-CoV-2感染患者的血浆血管紧张素Ⅱ水平明显升高，且与病毒滴度和肺损伤程度呈线性相关，提示SARS-CoV-2感染可能导致患者肾素-血管紧张素系统失衡,引起急性肺损伤。COVID-19明确的发病机制有待进一步的大数据研究证实。

3.2SARS-CoV-2与心血管系统 HUANG 等[4]通过对早期41例COVID-19患者的研究发现，12% COVID-19患者合并心肌损伤，提示SARS-CoV-2感染会引起心肌损伤，考虑可能与COVID-19患者体内Th1与Th2反应平衡被破坏有关。这与部分病例最初并无发热、乏力等症状，而以心慌、胸闷等为临床首发症状相符合。赵蕊等[16]通过对28例COVID-19患者分析发现，在治疗过程中患者出现心肌酶升高，尤其肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)升高最为明显。ACE2在人体心血管内皮细胞和心肌细胞中也有表达[14]，因此推测SARS-CoV-2可能也通过ACE2受体结合引起一系列ACE2受体信号级联反应，在心脏损伤中发挥作用[17]。此外，COVID-19伴随症状也会对心血管系统产生影响，发热可引起心率增快、心肌耗氧量增加、心排血量下降，从而可能诱发患者缺血加重或心力衰竭。持续的缺氧导致细胞凋亡等一系列细胞损伤；低氧还会诱导炎性反应，导致组织进一步缺血，可能会造成非冠状动脉闭塞性心肌梗死[18]。此外，病毒也可能直接感染心肌细胞，造成病毒性心肌炎。

3.3其他 少数病例出现轻度纳差、乏力、精神差、恶心呕吐、腹泻、头痛、结膜炎等症状[19]，考虑与SARS-CoV-2感染导致的其他器官或系统损伤有关，目前仍有待临床大样本研究加以证实。

4 SARS-CoV-2的分子生物学检测

SARS-CoV-2感染机体后，病毒RNA是最先能被检测到的标志物，而人体免疫系统产生的抗体(IgM、IgG)往往滞后于病毒核酸。因此，SARS-CoV-2核酸检测仍然是目前COVID-19最主要的检测方法。

4.1实时荧光RT-PCR 实时荧光RT-PCR可从基因水平检测病毒，因其灵敏度高，特异性强，快速简便，成本较低，成为目前使用的主要确诊方法。

4.1.1标本的选择 李萍等[20]通过对呼吸道标本核酸检测阳性的患者的粪便、血清和尿液标本进行核酸检测，结果显示粪便标本SARS-CoV-2阳性，而血清和尿液标本未检出阳性结果。陈炜等[21]通过对 4 例COVID-19确诊病例的咽拭子与痰标本进行核酸检测发现，痰液标本中病毒载量高于咽拭子标本，提示在SARS-CoV-2感染病例的分子生物学检测中痰标本的检测意义优于咽拭子标本。在《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案(试行第六版)》中核酸检测的常用标本除鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液外，还增加了粪便标本，同时建议为了提高核酸检测阳性，尽可能留取痰标本进行检测。

4.1.2标本的灭活 由于SARS-CoV-2存在极强的传染性，使得实验室检测人员感染的风险大大增加，因此对于标本进行灭活处理可以在一定程度上降低感染风险。《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案(试行第六版)》中提到，SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min和75%乙醇处理下会被灭活。陈培松等[22]通过回顾性分析2例SARS-CoV-2核酸检测阳性患者的咽拭子标本发现，56 ℃ 30 min和75%乙醇灭活处理对SARS-CoV-2核酸检测无明显影响。但该研究样本量少，后续还需大量SARS-CoV-2灭活后核酸检测数据进一步对该结果进行验证。

4.1.3实时荧光RT-PCR检测 目前国家批准的产品对SARS-CoV-2的核酸检测均是通过靶向特定区域，对病毒的ORF1ab、N基因、E基因这3个位点进行荧光定量检测。根据引物和探针的不同，分为单靶标(ORF1ab)、双靶标(ORF1ab、N基因)、三靶标(ORF1ab、N基因和E基因)检测。由于SARS-CoV-2为RNA病毒，易降解，采集标本时应避免使用含RNA酶的储存管。获得患者标本后，首先对标本进行核酸提取，提取后先将RNA反转录为cDNA，再进行扩增检测，最后通过荧光定量PCR得到标本Ct值，最终判断患者标本中是否含有SARS-CoV-2。具体操作参照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)》[23]及《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》[24]等。

4.1.4检测结果判断 要确认一个病例为阳性，需满足同一份标本中SARS-CoV-2的三靶标或者双靶标特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如受实验室检测试剂盒限制，只能做一个靶标检测，应至少针对SARS-CoV-2最为保守及特异的ORF1ab区域进行检测，两份标本(不同部位及不同类型)检测均为阳性才能判读为阳性结果。同时，阴性结果不能排除SARS-CoV-2感染，应考虑实验中导致假阴性的原因(标本采集是否合格、采集时间是否准确及时、标本保存运输及处理是否符合条件、是否处于方法学窗口期、实验人员技术误差、是否存在PCR抑制物等)[23]，对原因进行逐一排除。

4.2基因测序技术 宏基因组二代测序法(mNGS)是以宏基因组为研究对象，直接利用高通量测序对临床标本中的基因组进行检测，实现病原微生物的快速识别、性能鉴定、功能研究以及微生物间、微生物与环境间相互关系的研究[25]。CHEN等[25]通过 mNGS对COVID-19患者的肺泡灌洗液进行快速检测，检出了SARS-CoV-2，并通过分析发现SARS-CoV-2基因组与蝙蝠SARS-CoV ZC45基因组具有高度同源性。相较于实时荧光 RT-PCR，mNGS既可以鉴定新的病毒株，也可用于检测早期低病毒含量标本，更能对实时荧光RT-PCR检测可疑或灰区结果进行确认。但目前大多数医院缺乏测序设备，缺乏相关专业人员来协助测序结果的解读，缺乏研发阶段的流程和试剂配比的优化，缺乏阳性和阴性参考品的设立以及初步预临床试验的支持；同时mNGS成本较高、检测周期较长，故不适合于常规临床检测。

4.3数字PCR(dPCR) dPCR是指通过将一个标本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与传统PCR相比，其采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照标本，直接检测目标序列的拷贝数,具有更高的灵敏度、特异性、精确性，而且在极微量核酸标本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有优势。与RT-PCR相比，dPCR可检测到单分子级别的靶标 DNA，甚至可以检出0.001%以下的突变率，可快速检出痕量病毒，为有效筛选病毒携带者提供了条件。但dPCR系统成本高，通量有限、操作繁琐，使得临床应用受限。

4.4其他检测方法 目前，针对RNA病毒较成熟的核酸诊断技术还有反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、基于 CRISPR/Cas 基因核酸检测技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和基因芯片等，但尚未出现上述方法在SARS-CoV-2检测中具体应用的相关报道。

5 小 结

目前SARS-CoV-2尚无特效治疗方法，主要的治疗仍是对症支持治疗。但在疫苗研制的科研攻关应急项目中并行安排了多条技术路线，包括灭活疫苗、mRNA疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗等并行推进，部分疫苗制剂已经进入动物实验阶段。虽然目前我国SARS-CoV-2感染的新增病例数逐渐减少，治愈病例数逐渐增加，但防控任务仍然艰巨，疫情防控各项措施仍需要严格落实，应继续控制传染源、及时检测、早期诊断、报告、隔离、支持性治疗和及时发布疫情信息。对个人来说，良好的个人卫生习惯、注意个人防护、室内保持通风等也均有助于预防SARS-CoV-2的感染。