环介导等温扩增技术在肺结核诊断中的应用价值

李晓伟,杨 伟,赵先进

山西省长治市人民医院检验科,山西长治 046000

由结核分枝杆菌感染引起的结核病是目前流行最广的传染性疾病，全球每年新发结核病患者800万～1 000万例，死于结核病的人数高达180万例。所以，如何快速进行临床诊断是结核病防控的关键所在。传统的检测技术灵敏度较差，阳性检出率低，容易漏诊。结核分枝杆菌培养是诊断结核病最为直接和可靠的依据，但是培养周期长，不利于结核病的及时诊断和治疗。NOTOMI等[1]于2000年提出了环介导等温扩增技术(LAMP)，这是一种新的核酸扩增技术，在恒温条件下即可快速完成核酸的扩增，而且无需购置昂贵的核酸扩增仪，操作过程简单，不容易污染，近年来已得到广泛的应用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年1月在本院感染性疾病科就诊的295例疑似结核病患者为研究对象，其中男190例，女105例。

1.2仪器与试剂 显微镜(日本奥林巴斯)；低温高速离心机(上海安亭飞鸽牌)；生物安全柜(上海复兴医学科技有限公司)；PCR扩增仪(日本荣研)；抗酸染色试剂(珠海贝索生物制剂公司)；LAMP试剂(日本荣研，批号:96002)。

1.3方法

1.3.1标本采集 嘱患者清晨漱口，咳深部痰于一次性无菌杯中立即送检，每人送检2份或3份痰液标本，随机抽取一份，共295份痰标本，进行涂片抗酸染色并做LAMP试验，对试验结果进行分析和比对。

1.3.2痰涂片抗酸染色 涂片、染色、显微镜检查操作参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》进行。结核分枝杆菌涂片抗酸染色镜检报告方式：至少检查300个视野未发现抗酸菌(-)，1～2个抗酸菌/300个视野为±，1～9个抗酸菌/100个视野为+，1～9个抗酸菌/10个视野为++，1～9个抗酸菌/视野为+++，>9个抗酸菌/视野为++++。

1.3.3LAMP试验

1.3.3.1DNA提取 试剂盒通过对标本中所含的细菌进行破碎处理，使其所含的核酸游离到溶液中，并将得到的溶液与吸附剂试剂管中的多孔介质混合，把标本中所含的阻碍核酸扩增反应的物质去除，再通过滴注盖薄膜滤器，使核酸溶液被提取出来。

1.3.3.2LAMP扩增 确认恒温荧光核酸扩增仪温度已达到67 ℃，将反应试管放入扩增仪中，开始进行扩增反应，反应时间为40 min[2]。

1.3.3.3结果判读 扩增反应结束后，将反应试管放在LF-160荧光目视检测装置上，从反应试管的侧面进行观察；在确认阳性对照发出绿色荧光，阴性对照没有发出荧光后，对所检测标本进行判定，发出绿色荧光者为阳性，未发出荧光者为阴性。

1.3.4肺结核诊断原则 肺结核的诊断是以病原学(包括细菌学、分子生物学)检查为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关的辅助检查及鉴别诊断等，进行综合分析作出诊断，以病原学、病理学结果作为确诊依据。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，以临床诊断结果为标准，比较痰涂片抗酸染色镜检法和LAMP的检测效能，计算灵敏度和特异度，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。各检测方法与临床诊断结果的一致性评价采用Kappa检验，Kappa值≤0.40时，两者一致性差；Kappa值>0.40～<0.75时，两者中度一致；Kappa值≥0.75时，两者一致性较高。

2 结 果

2.12种方法对结核分枝杆菌的阳性检出率比较 在295例研究对象中，LAMP的阳性检出率为51%(150/295)，显著高于痰涂片抗酸染色法的17%(51/295)，差异有统计学意义(χ2=23.65，P<0.001)。

2.22种方法对结核分枝杆菌的检测效能评价 在本院感染性疾病科就诊的295例疑似结核病患者中，临床诊断肺结核的患者为180例，非肺结核患者为115例。以临床诊断为标准，痰涂片抗酸染色法灵敏度为28%(50/180)，特异度为99%(114/115)，阳性预测值为98%(50/51)，阴性预测值为53%(114/214)，Kappa值为0.17；LAMP检测灵敏度为83%(149/180)，特异度为99%(114/115)，阳性预测值为99%(149/150)，阴性预测值为79%(114/145)，Kappa值为0.70。LAMP检测的灵敏度显著高于痰涂片抗酸染色法，差异有统计学意义(χ2=12.31，P<0.001)。

2.3LAMP在痰涂片抗酸染色阴性标本中检测结核分枝杆菌的效能评价 以临床诊断结果为标准，在244例痰涂片抗酸染色阴性的标本中，LAMP的阳性检出率为40%，灵敏度为77%，特异度为99%，Kappa值为0.90。

3 讨 论

目前，我国结核病防控形势严峻，提高结核病的诊断及治疗能力，对结核病的防治工作具有重要意义。传统的检测方法，虽然成本较低，但是灵敏度较低、特异性较差，检测周期长、检出率低，这些都限制了其诊断效能。LAMP作为一种快速分子检测方法初步应用于本省各级结核病实验室，这对于提高本省的肺结核患者病原学阳性检出率具有重要意义[3]。

本研究结果显示：以临床诊断为标准，LAMP的阳性检出率为51%，明显高于痰涂片抗酸染色法的17%，LAMP诊断肺结核的灵敏度(83%)显著高于痰涂片抗酸染色法(28%)，这与国内外研究结果一致。痰涂片抗酸染色主要是以典型的杆状形态为病原学报告依据，因为环境和个体差异等因素影响,结核分枝杆菌形态呈现多样化，球状、短杆状、丝状、细胞壁缺陷的L型等,除了形态多样化，检验人员的识别能力，阅片的时间和范围，染片的质量等等都会影响结果的判读，故可能出现假阴性的情况，灵敏度较低[4]。有文献报道痰标本的细菌载量在5 000～10 000/mL时，涂片镜检才会报告阳性[5]。LAMP具有许多优点,使用高效的DNA聚合酶和2对引物，识别靶基因的6个不同区域，特异性强,灵敏度高,检测时间短,无需昂贵的核酸扩增仪和检测设备，在等温条件下即可完成扩增反应[6-8]，产物易检测，同时整个反应始终在密闭的环境进行，仪器自动判断结果，实验室交叉污染风险低，适用于基层医院结核病的诊断[9]。

以临床诊断为标准，LAMP与临床诊断结果中度一致(Kappa值=0.70)，痰涂片抗酸染色与临床诊断结果一致性差(Kappa值=0.17)，由此可见，LAMP对结核病的诊断有着重要的意义。本研究表明，在痰涂片抗酸染色阴性的244例患者中，LAMP检测的灵敏度和特异度分别是77%、99%，与临床诊断结果相比，一致性较高(Kappa值=0.90)，在痰涂片抗酸染色阴性的患者中阳性检出率达40%，比国内报道LAMP对痰涂片抗酸染色阴性标本的阳性检出率在20%～30%的结果略高，以上数据提示LAMP对于检测痰涂片抗酸染色阴性标本肺结核患者也具有一定的技术优势[10]。

综上所述，在诊断肺结核时，LAMP具有较高的应用价值，阳性检出率和灵敏度均明显高于痰涂片抗酸染色，尤其在痰涂片抗酸染色阴性的结核病诊断中有较高的临床应用价值。但本研究具有标本来源单一、样本量少等局限性，可能在一定程度上对研究结果造成影响，在评估LAMP试验的临床应用价值时，还需增加样本数量并进一步研究。多种检测方法联合应用降低漏检率和误诊率，才能有效诊断结核病。