实时荧光环介导恒温扩增技术检测布鲁菌方法的建立与评价

郄春花，刘晔华，刘亚敏，李 颖，崔军文

1.天津市第二人民医院检验科，天津 300192；2.天津市第一中心医院检验科，天津 300192；3.天津市第二人民医院感染科，天津 300192；4.天津农学院基础科学学院，天津 300384

布鲁菌病是一种人畜共患病，已成为一个重要的公共卫生问题。为了控制和减少疾病在动物之间的传播以及传染给人类的风险，需要对病原体进行快速、准确的检测。临床上用于确诊布鲁菌病的方法主要依靠血液及骨髓的细菌培养和血清学检查，由于布鲁菌生长缓慢，细菌培养耗时长，且受血清中抑菌物质及抗生素的影响，难以达到早期诊断的目的[1]。环介导恒温扩增技术(LAMP)是NOTOMI等[2]开发的一种新型核酸体外扩增技术。LAMP不仅广泛应用于病原微生物检测,而且具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、操作简单等优点,特别适合病原微生物的现场即时检测[3]。本研究针对布鲁菌属保守基因OMP 25设计LAMP引物，建立了一种实时荧光环介导恒温扩增(RealAmp)方法，该方法简便、快速，以期实现布鲁菌的现场即时检测。

1 材料与方法

1.1菌株来源 实验用菌株如下：布鲁菌标准菌株猪种布鲁菌S2由天津市动物疫病控制中心李秀梅老师赠送。16株布鲁菌临床分离株由天津市第二人民医院微生物室保存。金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、铜绿假单胞菌ATCC 27853、粪肠球菌ATCC 29212购自天津市临床检验中心。

1.2仪器与试剂 恒温荧光检测仪Fluo-Gene为北京弗罗朗生物科技有限公司产品；RealAmp试剂盒购自北京弗罗朗生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技公司；人血液基因组提取试剂盒购自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1引物设计与合成 根据GenBank中布鲁菌序列(No.AM694198.2)，针对布鲁菌属保守基因OMP 25，利用LAMP引物设计软件设计4套引物，每套引物由F3、B3、FIP、BIP、FB和LB组成。引物序列由北京三博远志生物技术有限公司合成。LAMP引物的序列为F3：5′-CGT CGG CTA CGA CCT GAA-3′；B3：5′-ACC GGC CAG ATC ATA GTT CT-3′；FIP：5′-TCG TCC AAG CCG TTG TTA AGC TCC CGG TTA TGC CGT ACC T-3′；BIP：5′-GTG CCG GTC TCG AAG CCA AGT GTT GCC GTA CTG GGT GTA-3′；FB1：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG CC-3′；LB1：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB2：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG C-3′；LB2：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB3：5′-TGC GAA CCG GCA ATA CCA GC-3′;LB3：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB4：5′-CTG CGA ACC GGC AAT ACC AGC-3′；LB4：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′。

1.3.2细菌DNA模板的制备 向1.5 mL EP管中加入0.5 mL生理盐水，然后用接种环在管壁上研磨成菌悬液，于80～90 ℃灭活30 min，12 000 r/min离心10 min后去掉上清液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA，保存在-20 ℃备用。

1.3.3RealAmp反应体系 首先，将各引物分别配成工作液，FIP、BIP、F3、B3、FB、LB按照8∶8∶1∶1∶4∶4水平比混合成引物混合液。按照RealAmp试剂盒说明书配制RealAmp反应体系。反应过程在恒温荧光检测仪Fluo-Gene中进行，反应温度为65 ℃，反应时间为60 min。以2 μL无菌蒸馏水为模板设置阴性对照。以提取的标准菌株猪种布鲁菌S2的DNA为模板，按照RealAmp试剂盒说明书的要求设置反应条件，比较4套引物的扩增效率，选择扩增效率最高的引物进行后续实验。

1.3.4RealAmp检测布鲁菌的特异性验证 提取过夜培养的标准菌株猪种布鲁菌S2、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希菌ATCC 25922、大肠埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、铜绿假单胞菌ATCC 27853、粪肠球菌ATCC 29212的细菌DNA，取2 μL作为模板，分别进行RealAmp反应，验证该方法的特异性。

1.3.5RealAmp检测布鲁菌的灵敏度实验 提取过夜培养的标准菌株猪种布鲁菌S2的细菌DNA，调整模板DNA水平为120 ng/μL，用无菌蒸馏水进行1∶10、1∶102、1∶103连续倍比稀释直到1∶109，分别取稀释后的DNA 2 μL作为反应模板，用于RealAmp反应，验证方法的灵敏度。

1.3.6临床应用 提取培养的布鲁菌临床分离株的DNA，用RealAmp进行检测。抽取疑似布鲁菌病患者外周血2～3 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，患者同时抽取5～10 mL外周血做血培养。按照人血液基因组提取试剂盒的要求提取人全血基因组DNA，用已建立的RealAmp方法进行患者外周血微量布鲁菌DNA检测。

2 结 果

2.1最佳引物的筛选 当反应进行至10 min左右时，实验管的荧光强度大幅度增加，直至反应结束，仪器判定为阳性结果。阴性对照管荧光曲线一直处于平滑的状态，直到反应终止也没有发生大幅度的曲线斜率的变化，仪器判定为阴性结果，说明没有发生扩增反应。实时荧光曲线表明，所有实验管都在10 min左右扩增出目的基因。比较4套引物的扩增效率，选择扩增效率最高的第2套引物进行后续实验。

2.2特异性实验 以非布鲁菌标准菌株DNA为模板，本实验均未出现扩增反应，只有猪种布鲁菌S2的DNA发生特异性扩增并被检测出来。说明本研究的RealAmp方法对布鲁菌检测的特异性好，与非目标菌不存在扩增反应。

2.3灵敏度实验 布鲁菌标准菌株DNA 1∶10～1∶107各水平检测结果均为阳性，而1∶108、1∶109为阴性。RealAmp检测布鲁菌的灵敏度为1.2×10-5ng/μL。

2.4临床应用 用RealAmp方法检测16株布鲁菌临床分离株的DNA后，扩增结果均呈阳性，表明该方法可用于布鲁菌DNA的检测。抽取28例疑似布鲁菌病患者外周血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，患者同时抽取5～10 mL外周血做血培养。提取EDTA-K2抗凝血中的血液基因组DNA，用已建立的RealAmp方法进行患者外周血微量布鲁菌DNA检测。其中12份标本RealAmp检测为阳性结果，阳性率为42.9%；28份标本血培养结果显示，11份标本为血培养阳性，阳性率为39.3%。新建的RealAmp方法与血培养的符合率为96.4%(27/28)。

3 讨 论

布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种传染变态反应性疾病，家畜和野生动物被认为是传染源[4]。因为布鲁菌病是一种全身性感染，可以影响任何器官或系统。布鲁菌病具有独特的流行病学和致病特征，其中一个独有的特征是菌血症在疾病发生、发展过程中的作用非常重要[5]。布鲁菌病诊断的金标准是从血液或骨髓等培养物中分离出布鲁菌[6]。目前布鲁菌血症的实验室诊断依赖于血培养，因此建立快速检验布鲁菌血症的RealAmp方法，对布鲁菌血症的诊断和治疗具有重要的意义。

LAMP通过设计的引物和置换DNA扩增技术，在30～60 min的恒温条件下(通常为60～65 ℃)，利用高活性链置换Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，产生大量茎环状扩增产物，从而实现对目的基因的快速检测。LAMP自开发以来，已广泛应用于细菌、病毒和寄生虫的检测[7-9]。LAMP方法不仅对核酸提取要求低，而且灵敏度高，可从极微量的标本中扩增出目的基因，其灵敏度是传统PCR的10～100倍[10]。LAMP反应最重要的优点是可以在恒定温度下进行，不需要依赖特殊设备[11]。LAMP产物检测最初应用琼脂糖凝胶电泳，后来开发了基于反应过程中的副产物(白色焦磷酸镁沉淀)浊度的肉眼或浊度仪检测来判定扩增与否。最近，使用实时监测荧光信号提高了扩增信号的可靠性[12]。

本研究建立的针对布鲁菌OMP25基因的RealAmp方法只针对布鲁菌扩增，对其他干扰菌不扩增，显示出良好的特异性。本实验选用的恒温荧光检测仪Fluo-Gene及配套的RealAmp试剂盒，操作简便、结果可视化，整个实验在30 min内即可完成。恒温荧光检测仪Fluo-Gene的应用，不仅使操作者远离了溴化乙锭、紫外灯等对身体的危害，而且实现了对病原菌从始到终全封闭式检测。目前，市场上常见的LAMP平台主要有 Eiken公司生产的LA-200，Lumora公司生产的BART和 Optigene公司生产的GenieⅡ[13]。本实验中应用的检测平台Fluo-Gene所需要的时间最短，整个扩增过程仅需20 min。

本研究建立了特异、灵敏和可靠的RealAmp方法用于布鲁菌DNA检测。该方法能够从布鲁菌血症患者外周血提取的DNA样品中扩增出微量的布鲁菌DNA，灵敏度可达1.2×10-5ng/μL。来自疑似布鲁菌病患者的28份临床标本，虽然RealAmp检测阳性率与传统的血培养(39.3%)阳性率基本持平，但是RealAmp仅需要外周血2～3 mL，且当天即可得出结果，而血培养时间至少需要5 d，甚至20多天。与血培养相比，RealAmp简便、快捷，可以方便地实现布鲁菌血症的现场即时检测。

综上所述，本研究针对布鲁菌OMP25基因建立的RealAmp方法具有特异性强、灵敏度高、简便高效等特点，为布鲁菌的快速检测提供了新的发展方向，具有良好的发展前景。