黑色素瘤发病过程中与肿瘤相关成纤维细胞间的相互作用

胡泰然，雷铁池

(武汉大学人民医院皮肤科，武汉 430060)

皮肤黑色素瘤是一种最具侵袭性和致命性的皮肤癌症，被认为是一种由遗传易感和环境暴露等病因引发的多因素疾病，大多数由黑色素细胞形成的痣和色素斑恶变而来，其在皮肤癌症相关死亡率中的占比较高。晚期黑色素瘤极具侵袭性，可经血液系统和淋巴系统发生远处转移，同时对传统化学疗法和放射疗法具有特征性抵抗，预后较差[1-3]。既往研究表明，黑色素瘤的形成不仅仅与单一的恶性细胞有关，还与肿瘤基质及肿瘤基质细胞所构成的肿瘤微环境密切相关，包括肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、间充质干细胞、内皮细胞和免疫细胞等[4]。其中，CAFs是肿瘤微环境中最主要的基质细胞之一，近年来，CAFs与肿瘤细胞的相互作用一直受到人们的广泛关注。有证据表明，CAFs通过与肿瘤细胞的直接或间接接触，在肿瘤发生、发展和转移中发挥重要作用，使CAFs成为肿瘤治疗的潜在靶点[5]。同样，在黑色素瘤发病过程中，正常成纤维细胞(normal fibroblasts，NFs)可在黑色素瘤细胞诱导下活化形成CAFs，并与黑色素瘤细胞相互作用，促进肿瘤的生长、侵袭、致密结构形成、血管形成、转移甚至耐药[3]。因此，总结并阐明黑色素瘤与CAFs间的相互作用机制对黑色素瘤治疗新靶点的发现具有重要意义。现就黑色素瘤发病过程中与CAFs间的相互作用予以综述。

1 黑色素瘤中CAFs的起源和形成

1.1NFs与CAFs的特征 正常组织中的成纤维细胞是非上皮、非免疫性细胞，表现出经典的纺锤形形态，具有可能的间充质谱系起源，通常以单细胞的形式存在于间质中，偶尔存在于毛细血管附近，与基膜无关联。NFs通常处于静止状态，其代谢和转录组学活性极低。NFs具有分化为活化的成纤维细胞的能力，并可在随后基于适当的刺激产生其他间充质谱系细胞[5]。

此外，CAFs还可指活化的成纤维细胞或活化的肌成纤维细胞，包括肿瘤相关的间充质干细胞，其表型与NFs完全不同，而与肌成纤维细胞非常相似[5-6]。活化后的成纤维细胞可以获得更多的分泌表型、更强的增殖特性、专门的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)重塑能力、强大的自分泌活化和动态免疫信号调节功能，进一步增加了肿瘤纤维化和肿瘤微环境的动态复杂性[4,7]。虽然CAFs和NFs均表达成纤维细胞特异性标志物，但α-平滑肌肌动蛋白、S100A4蛋白和成纤维细胞活化蛋白α等活化标志物分子仅在CAFs中表达[6]。

1.2NFs对早期黑色素瘤的抑制作用 在黑色素瘤发展的早期阶段，NFs似乎与CAFs的功能相反，使用体外共培养模型时，NFs对来源于原发性黑色素瘤病变的肿瘤细胞有抑制性影响[8]。另有研究表明，当黑色素瘤第一次发生时，基质中静息的成纤维细胞会形成屏障，并分泌一些细胞因子和化学因子，如γ干扰素、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α，它们相互作用并抑制黑色素瘤细胞的生长[9]。此外，皮肤NFs形成的物理屏障也能阻止黑色素瘤细胞迁移并侵入周围组织[3]。因此，NFs似乎抑制黑色素瘤在癌前病变时期的生长和进展。

1.3黑色素瘤主要以旁分泌方式促使CAFs的形成 随着黑色素瘤的发展，黑色素瘤细胞分泌多种化学因子，诱导NFs细胞向黑色素瘤迁移、包围，并渗入生长的黑色素瘤体[4]。这些信号还诱导基质中NFs的表观遗传和生化变化，从而形成CAFs。黑色素瘤中产生的血小板衍生生长因子CC刺激NFs向肿瘤的募集，并促使NFs活化为CAFs[9-10]。黑色素瘤中分泌的转化生长因子-β能诱导NFs分化和活化成为CAFs，且Nodal蛋白作为转化生长因子超家族成员，具有与之类似的功能[11]。

黑色素瘤细胞分泌的细胞外囊泡也可以诱导成纤维细胞重编程为CAFs。细胞外囊泡是由真核细胞释放或脱落到肿瘤微环境中的细胞外细胞器，如外泌体和细胞微泡等。它们含有各种生物活性蛋白、信使RNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)，可在恶性细胞、CAFs、间充质干细胞等细胞间被相互摄取，成为细胞间通讯的关键[12]。黑色素瘤细胞分泌的细胞微泡可介导NFs向CAFs转变，并调节血管细胞黏附分子-1的表达，从而增强黑色素瘤细胞与CAFs的黏附；在缺氧刺激下，黑色素瘤细胞微泡在成纤维细胞中诱导更多胞外信号调节激酶1/2磷酸化，导致血管细胞黏附分子-1表达增加，从而产生更强的黏附作用[13]。Dror等[14]报道，由黑色素瘤细胞分泌并被成纤维细胞吸收的黑素体miR-211可激活促分裂原活化的蛋白激酶信号通路，并诱导NFs重编程为CAFs。此外，黑色素瘤细胞释放的外泌体miR-155可以促进NFs中CAFs特异性活化标志物α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞活化蛋白的表达[15]。由此可见，黑色素瘤细胞主要以旁分泌形式影响NFs的表观遗传，并使其活化成为CAFs。

2 CAFs促进黑色素瘤的生长

各种体内外模型已证实CAFs对黑色素瘤生长的促进作用。如白细胞介素-6、白细胞介素-8、CXC趋化因子配体1、胰岛素样生长因子2、成纤维细胞生长因子7和转化生长因子-β3等参与了CAFs与黑色素瘤细胞之间的交互作用，上述细胞因子参与免疫反应，并诱导炎症发生、刺激黑色素瘤生长[3,10]。使用肿瘤异种移植模型对黑色素瘤进行研究发现，与NFs相比，CAFs能显著促进与其共注射的黑色素瘤细胞的生长，并可过度表达成纤维细胞活化蛋白，导致免疫抑制性肿瘤环境的产生[16]。因此，调节CAFs促进黑色素瘤生长的分子机制受到人们的关注。

在原位皮肤癌模型中，皮肤成纤维细胞中雄激素受体表达的下调能诱导CAFs活化的早期步骤，并增强黑色素瘤细胞的致瘤性。雄激素受体能抑制CAFs效应基因的转录过程，进而抑制肿瘤生长[17]。在软琼脂集落形成试验中，CAFs通过产生可溶性因子支持黑色素瘤细胞的生长；当阻断CAFs中的β联蛋白信号时，B-Raf激酶活化的同源性磷酸酶及张力蛋白可显著抑制缺陷小鼠体内黑色素瘤的生长。由β联蛋白消融导致的死亡CAFs可以释放促凋亡或生长抑制因子，从而诱导黑色素瘤细胞的细胞周期停滞和凋亡[16]。因此，皮肤成纤维细胞中的雄激素受体和β联蛋白在调控CAFs促进黑色素瘤生长的信号通路中均发挥重要作用。

3 CAFs有助于黑色素瘤致密结构的形成和耐药

黑色素瘤细胞主动募集成纤维细胞并刺激其分泌ECM，进而促进ECM的运动。在结构上，与仅存在黑色素瘤细胞的瘤体相比，黑色素瘤细胞与CAFs形成的共培养瘤体更小、更紧凑、更有条理。CAFs促成黑色素瘤致密结构形成的大致过程为：病程早期，发病部位只存在少量的游离黑色素瘤细胞和成纤维细胞。随后，黑色素瘤细胞刺激成纤维细胞，使其获得功能过度活化的特征，形成CAFs。除增殖性和运动性增强外，CAFs还释放了更多的生长因子和蛋白酶(如基质金属蛋白酶)，并增加ECM蛋白(如纤维粘连蛋白、肌腱蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白Ⅳ等)的表达，从而获得强大的ECM生物合成和沉积能力。随后，游离的黑色素瘤细胞迁移到ECM中稳定下来，形成固定的黑色素瘤细胞，并分裂产生新的游离黑色素瘤细胞。在分裂的过程中，固定癌细胞会在空间上进行自我封闭，最终形成封闭的隔室[3-5,10]。因此，实体瘤致密、纤维化的本质被认为是成纤维细胞浸润和ECM蛋白沉积的直接结果，这一结果可以防止治疗性药物到达黑色素瘤组织核心的黑色素瘤细胞处，从而促成肿瘤的耐药性。

4 CAFs协助黑色素瘤进行上皮-间充质转化的过程

在黑色素瘤中，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表现为从上皮细胞转变为具有功能性间充质表型的恶性黑素细胞，这一过程被认为具有驱动黑色素瘤细胞获得转移潜能和侵袭性质的作用。EMT的重要标志包括上皮钙黏素表达的下调和神经钙黏素表达的增加。正常黑素细胞存在于靠近基膜的表皮中，形成表皮黑色素单元，其中含有一个黑素细胞和多达36个角质形成细胞。正常生理情况下，由于上皮钙黏素的表达，黑素细胞黏附于角质形成细胞，导致黑素细胞生长、树突形成和黑色素瘤相关细胞表面分子的表达受限。随着黑素细胞的突变，恶性黑色素瘤细胞的增殖速度加快，且上皮钙黏素的表达向神经钙黏素转换。不同类型黏附分子间的表达转换导致黑色素瘤细胞与邻近角质形成细胞之间失去接触，并与表达神经钙黏素的CAFs相结合，促使黑色素瘤细胞远离角质形成细胞并侵入下方真皮，通过血液系统和淋巴系统迁移至远处组织，并建立转移[3,5,18]。

除上皮钙黏素和神经钙黏素外，其他的EMT标志物(Snail1、Snail2、锌指E盒结合蛋白1、锌指E盒结合蛋白2、Twist和Claudin-1等)也在黑色素瘤的EMT过程中发挥了重要作用。通过上调上皮标志物(上皮钙黏素)和下调间充质标志物(锌指E盒结合蛋白1和锌指E盒结合蛋白2)显示，CAFs失活后，黑色素瘤细胞中的EMT过程受阻[16]。细胞极性的丧失是EMT过程的关键，而紧密连接蛋白Claudin-1积极参与维持上皮细胞的顶端-基底极性，因此，CAFs失活后Claudin-1表达增加进一步证明CAFs促进了EMT过程。此外，阻断CAFs中β联蛋白的信号转导后，黑色素瘤细胞中锌指E盒结合蛋白1和Snail的表达下调，且与Claudin-1表达增加相关[16,19]。可见，β联蛋白不仅在CAFs促进黑色素瘤生长中十分关键，而且在EMT过程中也发挥重要作用。

5 CAFs与黑色素瘤通过相互作用促进肿瘤血管生成

黑色素瘤是高度血管化的肿瘤，因为CAFs可通过分泌一些促血管生成因子作用于黑色素瘤，以促进肿瘤血管生成，如血管内皮生长因子A、成纤维细胞生长因子2以及基质金属蛋白酶等蛋白水解酶[15,20]。血管内皮生长因子A和成纤维细胞生长因子2可与血管内皮细胞结合并激活各种信号转导途径下游，从而促进血管内皮细胞的增殖、扩散和迁移[15]。CAFs分泌的基质金属蛋白酶13可通过释放ECM中的血管内皮生长因子促进肿瘤血管生成，从而增加鳞状细胞癌或黑色素瘤的侵袭[21]；而CAFs分泌的基质金属蛋白酶9是一种促血管生成的ECM重构酶，能帮助重建ECM，以促进血管内皮细胞穿过ECM构成的结构屏障[15]。

另一方面，黑色素瘤也通过旁分泌方式加强CAFs的促肿瘤血管生成作用。如结缔组织生长因子可由CAFs表达，并在黑色素瘤中过表达，能诱导基质和肿瘤中CAFs的活化，并进一步导致内皮标志物CD31/血小板内皮细胞黏附分子的表达水平升高，最终增加肿瘤血管的体积[22]。此外，黑色素瘤细胞分泌的外泌体miR-155可以直接传递到成纤维细胞中，诱导CAFs的形成并抑制细胞因子信号转导抑制分子1的表达[15]。细胞因子信号转导抑制分子1表达的抑制会导致Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3信号通路的激活以及血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2和基质金属蛋白酶9的过度表达，触发CAFs的促血管生成作用[15,23]。

6 CAFs诱导黑色素瘤转移并参与转移前龛的形成

活化的CAFs在黑色素瘤的转移过程中不可或缺，是转移病变形成和发展的关键因素。CAFs分泌的分泌型卷曲相关蛋白2能激活黑色素瘤细胞中的多步信号级联，导致β联蛋白和小眼相关转录因子的减少，最终使肿瘤的血管生成和转移增加[24]。同时，CAFs还可以通过影响原发肿瘤ECM的硬度增强黑色素瘤细胞的侵袭，并可能产生ECM轨迹，以指导黑色素瘤细胞的侵袭[25-27]。

另外，在黑色素瘤远处转移过程中，CAFs参与了转移前龛的形成，并介导了转移部位继发性肿瘤的生长。转移前龛是可能发生肿瘤继发性转移的部位所形成的微环境，主要由CAFs、浸润性免疫细胞、内皮细胞等组成。转移前龛必须创造一个支持性微环境，以便经循环系统到达此处的恶性肿瘤细胞驻留、生长和建立第二个肿瘤[28-30]。在黑色素瘤中，CAFs参与了转移前龛的形成，并通过与肿瘤微环境和转移前龛中不同类型细胞的相互作用介导各种促进肿瘤转移的过程[31]。首先，黑色素瘤原发部位的CAFs可通过释放生长因子和细胞因子来增强转移，直接或间接刺激远处转移位点中黑色素瘤细胞的生长和侵袭[5,32]。对自发性黑色素瘤转移模型的研究显示，成纤维细胞在黑色素瘤肺转移微环境中被激活为CAFs：由转移性黑色素瘤细胞分泌的外泌体在肺成纤维细胞中激发肺成纤维细胞的活化，进而引发CAFs促炎基因的表达，发挥促炎功能[31]。转移到肝脏的黑色素瘤则依赖于肝星状细胞(肝脏驻留成纤维细胞)激活形成CAFs来支持肿瘤血管的生成[33]。

7 小 结

黑色素瘤细胞通过分泌各种化学因子、细胞外囊泡等诱导正常成纤维细胞活化成为CAFs；同时，CAFs也反过来直接或间接地影响黑色素瘤的进展，两者之间的相互作用机制可以为黑色素瘤治疗提供新思路：CAFs表达的结缔组织生长因子对于B-Raf激酶抑制性抵抗的黑色素瘤可能是一个新的治疗靶点；引发CAFs促血管生成启动的外泌体，miR-155可成为黑色素瘤抗血管生成疗法的潜在靶标；以黑色素瘤细胞和CAFs为共同目标的组合治疗有希望成为克服治疗抗性的新策略。在黑色素瘤细胞分泌的细胞外囊泡中，除miRNA外，其他组分对促进CAFs形成的作用，以及CAFs在黑色素瘤免疫逃逸中发挥的作用，仍需要进一步研究的证实。