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外周神经促进创伤后组织异位矿化的研究进展

2020-02-15覃文聘高鹏牛丽娜焦凯

医学综述 2020年17期
关键词:祖细胞肥大细胞矿化

覃文聘,高鹏,牛丽娜,焦凯

(军事口腔医学国家重点实验室 口腔疾病国家临床医学研究中心 陕西省口腔疾病临床医学研究中心第四军医大学口腔医院黏膜病科,西安 710032)

异位矿化是指在肌肉、肌腱和韧带等软组织内快速形成异位骨的疾病[1],大多由创伤性因素引起,常发生在髋、肘及肩等关节周围的囊外组织中,导致关节强直或血管和神经受压,严重限制关节活动并引起运动疼痛,从而影响患者生存质量[2]。目前,异位矿化主要采取辐射预防和外科切除治疗[3],然而治疗后复发率较高[4]。此外,上述治疗也会导致关节运动永久性受限、组织局部缺陷等并发症。因此,需进一步研究异位矿化的发生机制,以达到优化预防及治疗的目的。以往研究显示,多种发病机制参与了异位矿化的发生,如软组织损伤导致的反复出血机化、局部微循环缺氧、遗传因素及神经调节异常等[5]。研究表明,骨基质损伤后释放的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)具有诱导异位矿化的能力,损伤区BMP-2可促进感觉神经分泌P物质和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)等感觉神经肽,这些感觉神经肽的释放导致活化的血小板、肥大细胞和中性粒细胞聚集到损伤部位,最终启动软骨成骨过程;另外,活化的血小板、肥大细胞和中性粒细胞等的功能也与神经的重构有关[5]。现就外周神经促进创伤后组织异位矿化的研究进展予以综述。

1 神经炎症的作用

神经炎症机制在诱发异位成骨中的关键作用已被证明[2,6]。神经炎症是由感觉神经释放感觉神经肽(P物质[7]和CGRP[8])介导,并作用于周围的靶细胞(如肥大细胞)而产生的炎症级联。BMP-2常在创伤后释放入血,其已被证明能直接诱导感觉神经元释放神经炎症相关蛋白P物质和CGRP等,并能诱导新生血管[9]。Salisbury等[10]利用腺病毒转染的BMP-2过表达细胞建立小鼠异位矿化模型,在病毒转染细胞后24 h开始,每间隔一天从组织中分离出蛋白,通过酶联免疫吸附测定对组织内P物质和CGRP进行定量检测。结果发现,两种炎症介质的表达水平在诱导异位矿化后24 h内明显升高,在诱导后72 h和6 d再次升高。另有体外研究显示,在加入重组BMP-2后,感觉神经元培养基中的P物质和CGRP水平快速升高[11]。为了进一步证明P物质在诱导异位矿化中的作用,Kan等[12]用P物质受体——神经激肽-1受体拮抗剂RP-67580和对照溶剂磷酸盐缓冲液分别处理Nse-BMP-4异位矿化模型小鼠,结果发现RP-67580处理组的异位矿化诱导率显著低于对照组,表明P物质对于诱导异位矿化具有重要作用。由于感觉神经元末梢均有瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),TRPV1作为一种受到多种微环境因素刺激后释放疼痛调节剂的疼痛离子通道,在异位矿化中起作用。Salisbury等[10]以TRPV1敲除小鼠及野生小鼠为研究对象,建立BMP-2诱导的异位矿化模型。结果显示,与野生小鼠相比,TRPV1敲除小鼠异位骨形成量减少,且由BMP-2介导的P物质和CGRP增加也显著受到抑制,表明BMP-2能通过激活感觉神经TRPV1,促进其释放P物质和CGRP,进而诱导神经炎症的发生,从而促进异位矿化[10]。

在神经炎症过程中释放的P物质和CGRP两种感觉神经肽,已被证明能分别招募肥大细胞定位于周围神经和促进肥大细胞脱颗粒[13]。Salisbury等[10]分别使用肥大细胞脱颗粒抑制剂色甘酸和对照试剂磷酸盐缓冲液对小鼠进行预处理后,再采用BMP-2诱导异位矿化,10 d后对两组的新生骨进行量化比较,结果显示,色甘酸处理小鼠的异位成骨体积较对照小鼠显著减小,表明肥大细胞脱颗粒在诱导异位矿化发生中具有重要作用。肥大细胞脱颗粒后释放多种降解酶,包括乳糜酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶等,促进了包括神经在内的多种类型的组织重构。此外,许多神经末梢均有各种肥大细胞释放的蛋白受体,在肥大细胞脱颗粒后被激活,进一步促进P物质和CGRP的释放,构成一个促进神经炎症的正反馈环路[5]。另外,肥大细胞脱颗粒释放的血清素(5-羟色胺)与骨重建有密切联系[14]。血清素与其受体的结合会导致去甲肾上腺素的释放,去甲肾上腺素可激活β肾上腺素能受体信号通路并促进棕色脂肪组织在神经周围的迅速发生,从而进一步促进骨生成[15]。

基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一种能降解细胞外基质的明胶酶,其被证明与神经炎症和血神经屏障的开放有关[13]。Rodenberg等[16]在BMP诱导异位矿化的小鼠模型中发现,诱导后48 h内异位矿化部位的神经血管周围MMP-9高表达,7 d后微计算机断层成像检测到MMP-9定位的异位矿化形成部位,说明MMP-9在异位矿化形成中十分重要。Suehiro等[17]分别于伤后即刻与伤后1 d测定7例脑创伤患者全身动脉和颈内静脉血中的MMP-9和白细胞介素-6水平,结果发现颈内静脉中的MMP-9和白细胞介素-6水平与脑外伤炎症严重程度显著相关。Hackel等[18]运用高渗盐水处理大鼠,使MMP-9的非催化性血栓素结构域与低密度脂蛋白受体相关蛋白-1结合,触发胞外信号调节激酶1/2的磷酸化,诱导形成血神经屏障的紧密连接蛋白claudin-1下调,提示MMP-9与血神经屏障开放有关。Davis等[19]建立了腺病毒转染的BMP-2过表达细胞诱导异位矿化的大鼠和小鼠模型并进行对比研究,结果发现MMP-9无论在大鼠还是小鼠的异位矿化部位48 h内均有较高的表达,但在小鼠体内,MMP-9被激活,而在大鼠体内,MMP-9未被激活。同时,该研究在骨骼远端直接将腺病毒转染的BMP-2过表达细胞注入肌肉中,小鼠体内会出现异位矿化而大鼠体内不会出现。上述结果提示,MMP-9的激活对异位矿化至关重要。

可见,组织创伤导致局部BMP的大量释放,其可直接促进感觉神经肽释放,导致肥大细胞脱颗粒和神经炎症介质的释放,从而促进局部神经炎症发生,同时通过促进MMP-9的表达开放血神经屏障。

2 神经干细胞的作用

在异位矿化的形成过程中,关于骨祖细胞的来源有多种说法,包括来源于骨髓中的间充质干细胞[20]、肌肉纤维之间的间质细胞[21]、经上皮-间充质转化的内皮细胞[22]等。Lazard等[23]通过给小鼠肌内注射腺病毒转染的BMP-2过表达细胞诱导异位矿化,然后通过免疫组织化学方法追溯骨祖细胞来源,并用荧光激活细胞分类和免疫细胞化学方法对其进行定量和进一步表征。结果发现,24 h内存在于外周神经内膜的claudin-5阳性细胞同时表达成骨相关转录因子(Osterix,又称SP7,一种成骨标志物)抗体、血小板源性生长因子受体(参与神经胶质-内皮细胞相互作用的神经干或祖细胞标志物)、musashi家族蛋白(一种在完全分化的细胞中不表达,但对神经干细胞具有高度特异性的RNA结合蛋白)和酪氨酸激酶受体2(内皮标志物);48 h后这些细胞在神经内消失,随后出现在血液和新骨形成处,证明骨祖细胞来源于周围神经内膜的祖细胞。Olmsted-Davis等[24]通过建立三苯氧胺调控的Wnt1-Cre重组酶与td番茄红(Tomato red,TR)受体基因杂交的谱系追踪小鼠,即一种由三苯氧胺调控的TR系追踪小鼠来追踪细胞的神经内膜起源,同时使用抗体PS(phosphoSmad)1、 5和8检测对BMP-2有反应的细胞。在运用腺病毒转染的BMP-2过表达细胞诱导异位矿化模型中观察到,少量的PS阳性细胞存在神经内膜内;在周围神经的神经内膜中发现表达成骨细胞的特异性因子——SP7阳性细胞,在空腺病毒载体转导模型的周围神经中未观察到SP7阳性细胞;且观测到SP7、Dlx5(一种成骨细胞特异性因子)和PS在Wnt1+(TR+)细胞中表达。另外,Olmsted-Davis等[24]还对异位矿化患者标本进行了研究,发现异位矿化部位附近的神经内膜含有大量的PS阳性细胞,异位矿化患者的神经和骨组织中均存在SP7阳性细胞。上述结果表明,异位矿化的祖细胞来源于神经内膜。

骨祖细胞在发生后如何到达新骨形成部位并最终发挥作用引起了科研工作者的广泛兴趣。骨祖细胞要离开神经就必须穿过血神经屏障,研究发现循环中的祖细胞表面表达紧密连接分子claudin-5,但却不参与构成任何紧密连接结构,推测claudin-5的表达很可能为其穿过血神经屏障提供了一种方式[23]。祖细胞进入循环后会在几秒钟之内遍布全身,研究证实在机体受到创伤后,血液循环中会很快出现神经来源的骨祖细胞[13,25]。骨祖细胞最终定位在新骨形成部位,从循环渗出到特定部位的过程要通过一种特殊分化的血管,这些血管被鉴定为H血管,其特征为标志物CD31和内皮黏蛋白的高表达[26]。Ramasamy等[27]研究发现,骨祖细胞选择性地定位在H型毛细血管附近,但在骨干L型毛细血管(表达较低水平的CD31和内皮黏蛋白)周围不存在,进一步证实了H血管在骨祖细胞到达新骨形成部位的重要作用。

3 外周神经对棕色脂肪组织的调节作用

在BMP-2诱导的异位矿化模型中,神经、血管和肌肉等软组织也发生了一系列变化,其中棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)的出现是最早变化之一[5]。BAT是一种由冷暴露引起的独特脂肪组织,其特征为表达解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)和血管内皮生长因子。与电子传递链中的标准ATP酶不同,UCP1能将ATP酶从电子传递链复合物中解离出来,使用于ATP合成的能量会以热能的形式释放。周围神经中的小直径传入神经对热刺激做出反应,诱导信号转导并最终促进神经炎症发生[14]。此外,UCP1具有非常高的催化效率,能迅速消耗氧气,加之局部热量产生导致微环境中氧气的溶解度下降,最终造成细胞缺氧,从而有效促进了形成软骨凝结[28]。同时缺氧的BAT会激活缺氧诱导因子-1α通路,上调BMP、血管内皮生长因子和神经纤毛蛋白-1等的表达[29-30],促进成骨与成血管在异位矿化过程中的耦合[31]。

与异位矿化关系密切的棕色脂肪细胞不同于正常生理状态下的棕色脂肪细胞,它们是短暂存在的,且来源于神经。Salisbury等[32]对患者的异位矿化病理组织进行检测也发现,异位矿化中的棕色脂肪细胞表达UCP1,且表达关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α,但对正常棕色脂肪细胞的特征性标记CD137、TBX1(T-Box 1)、HOXC9(homeobox C9)的检测为阴性,同时也缺乏关键转录因子PRDM16(PR domain-containing protein 16)的表达。这些结果表明,异位矿化组织内的棕色脂肪细胞与机体本身的棕色脂肪细胞起源不同。在用三苯氧胺调控的TR系追踪小鼠来追踪细胞起源的实验中,Lazard等[23]采用BMP-2诱导异位矿化的小鼠模型进行研究,在诱导异位矿化5 d后,对组织进行免疫染色,证实大部分UCP阳性细胞同时TR阳性,提示棕色脂肪细胞可能来自神经内膜细胞。Salisbury等[15]采用BMP-2诱导异位矿化的小鼠模型进行研究发现,在BMP-2处理2 d后,坐骨神经内存在β3肾上腺素能受体阳性细胞,这些细胞也表达神经迁移标志物CD75;在处理4 d后,坐骨神经内的β3肾上腺素能受体阳性细胞数目显著减少,同时在周围的软组织内发现了β3肾上腺素能受体阳性UCP1阳性细胞,这些细胞同时表达神经引导因子颤蛋白;在阻断肥大细胞脱粒诱导的神经重构后,UCP1特异性RNA和蛋白表达完全消失,说明棕色脂肪细胞不仅起源于神经,且受神经炎症调控。Salisbury等[5]认为,肥大细胞脱颗粒释放的血清素会刺激损伤部位的交感神经细胞,进一步影响BAT的生成。另有研究发现,BAT的产生受交感神经系统的调节[5]。Lowell和Spiegelman[33]将交感神经在冷暴露或药物刺激下对BAT的影响归纳为急性和慢性,UCP-1活性在几秒钟内增加,而UCP-1蛋白的增加、线粒体的生物发生及BAT的增生和肥大发生在数小时或数天之内。实验发现,在犬和灵长类动物中使用β3肾上腺素能受体激动剂可以增加BAT含量[33];临床研究发现,嗜铬细胞瘤成年患者体内存在更多的棕色脂肪沉积,这些结果支持交感神经在BAT的诱导、发生过程起重要作用[33]。

4 小 结

创伤后组织异位矿化的过程与外周神经密切相关,主要包括神经炎症的作用、神经干细胞的作用和神经对棕色脂肪细胞的调控作用,从而导致血神经屏障开放、骨祖细胞迁移至新骨形成部位和BAT造成周围低氧环境并促进新生血管长入。虽然异位矿化被认为是一个异常的病理性矿化过程,但事实上其可能反映周围神经系统维持正常骨结构和功能的重要生理机制。生理状态下,周围神经系统将信号转导至中枢神经系统以调节正常骨骼的日常重构;病理状态下,BMP的释放刺激感觉神经,启动了一个超过正常水平的骨和软组织再生程序,可能导致不正确的部位出现骨质沉积,即形成异位矿化。因此,通过靶向调节神经炎症、神经干细胞和棕色脂肪细胞的作用可能成为临床阻断创伤后组织异位矿化的重要策略;此外,对异位矿化相关形成机制的研究亦可为牙、骨等硬组织缺损的治疗提供参考。

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