循环肿瘤细胞检测在膀胱癌诊疗中的研究进展

虞随，严泽军

(1.宁波大学医学院，浙江 宁波 315211； 2.宁波市第一医院泌尿外科，浙江 宁波 315010)

文献报道，2018年美国膀胱癌新增发病人数为81 190人，居恶性肿瘤发病的第六位，死亡人数为17 240人，居恶性肿瘤死亡的第八位，且膀胱癌在男性泌尿系恶性肿瘤中发病率最高，居恶性肿瘤发病率第三位[1]。在我国泌尿系统恶性肿瘤中，膀胱癌的发病率和死亡率均居第一位[2]。Ashworth[3]于1969年首次报道了癌症患者血液中循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)的存在。但局限于当时的科技水平，CTC检测未得到广泛应用。近年来，在精准医学理念的推动下，CTC检测正逐渐被认知，因其检测速度快、创伤小、灵敏度高、特异性强，并与肿瘤的复发转移密切相关，故在临床运用中发挥出巨大价值。截至目前，已有超过50种CTC检测方法，其中CellSearch®系统是CTC检测的唯一标准化平台，已获得美国食品药品管理局批准，用于分析转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者的血液[4]。一项荟萃分析表明，外周血中CTC的存在是膀胱癌患者预后不良的独立预测指标，可用于膀胱癌诊断[5]。目前，CTC检测在膀胱癌的诊疗中已逐步开展并显示出巨大潜力。现就CTC检测在膀胱癌诊疗中的研究进展予以综述。

1 CTC概述

1.1生物学特征 CTC是指从原发病灶脱落进入血液循环并与原发灶肿瘤细胞具有相似抗原和遗传特性的细胞。CTC的形成过程非常复杂，包括肿瘤细胞自身改变、从原发灶脱落、进入血管、逃过宿主免疫系统及避免血流剪切力、从血液循环中溢出、在继发部位种植增殖[6]。上皮-间充质转化被认为是其中最重要的步骤，通过修饰肿瘤细胞的形态结构、黏附分子及其骨架结构，使肿瘤细胞黏附能力下降、可塑性增强，造成肿瘤细胞脱落，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶则使得其迁移能力增强，从而使肿瘤细胞播散、迁移进入血液循环[7]。CTC是肿瘤复发和转移的最直接因素[8]，然而CTC占所有单核血细胞的比例不到0.004%[9]。由于CTC的稀缺性，对单个细胞进行浓缩、检测、鉴定和分析需要精细的技术，这增加了临床实践中实施CTC检测标准化的难度[10]。

1.2检测方法 目前已有许多分离检测CTC的方式，但膀胱癌中的大多数CTC研究依赖于CellSearch®系统。该系统采用阳性富集技术，通过捕获上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM) 阳性CTC，能够捕获到血液中的上皮型、上皮-间充质混合型CTC，是唯一被美国食品药品管理局批准用于CTC检测的标准化平台[4]。已有文献证实，膀胱切除标本中96%的膀胱肿瘤表达EpCAM[11]。然而CellSearch®系统存在一定缺陷，其测定可能无法检测出失去EpCAM和(或)肌酸激酶表达的细胞，而这些细胞常在上皮-间充质转化期间产生。在膀胱癌和其他实体恶性肿瘤中，上皮-间充质转化对肿瘤细胞转移过程至关重要[12-13]。但目前尚未有任何仪器能够检测到经历上皮-间充质转化的细胞。因此，独立于EpCAM表达的CTC捕获的测定，如针对细胞大小、形态、密度和电荷可能是新的研究方向[14]。与CellSearch®系统不同，AdnaTest®系统不完全依赖于EpCAM阳性CTC，还可检测其他上皮标志物，如表皮生长因子受体和人表皮生长因子受体-2，已被运用于膀胱癌的检测[15]。而Chalfin等[14]使用新型无选择AccuCyte-CyteFinder系统，对膀胱癌患者一系列阶段中的CTC进行计数和标记发现，这种无选择方法能够识别EpCAM阳性以及EpCAM阴性CTC。利用这种新方法，可以在非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)患者中检测到使用CellSearch®系统检测可能遗漏的EpCAM阴性CTC。另外，Ajjai等[16]发现，与CellSearch®系统相比，使用IsoFlux方法在膀胱癌中检测CTC具有更高的敏感性；在匹配的9例样本中，IsoFlux测试显示4例样本(44%)中有10个或更多CTC，而使用CellSearch®系统在所有样本中均未检测出。

一项针对膀胱癌患者的荟萃分析提示，CTC的总体灵敏度和特异度分别为0.35(95%CI0.28～0.43)和0.97(95%CI0.92～0.99)，阳性似然比和阴性似然比分别为11.2(95%CI4.5～27.5)和0.67(95%CI0.60～0.76)，诊断比值比为17(95%CI6～43)[5]。由于目前各种检测CTC的技术均存在其优缺点，故将不同的检测方法联合能提高CTC检测的敏感性和特异性。同时，亟需进一步开发敏感性和特异性更高的CTC检测技术。

2 CTC在膀胱癌诊治中的应用

2.1诊断 研究表明，外周血CTC检测有助于膀胱癌患者的诊断[17-18]。Naoe等[17]首次报道了使用CellSearch®系统检测膀胱癌患者外周血中的CTC。该研究通过对14例转移性膀胱癌患者的外周血进行检测发现，8例(57%)患者外周血存在CTC，而另外12例非转移性膀胱癌患者的外周血中均未检测到CTC，提示膀胱癌可能具有转移的风险。Gazzaniga等[18]报道了CTC阳性患者与肿瘤T1分期之间存在关联，而在所有Ta分期疾病中均未检测到CTC，这从生物学的角度证实了Ta和T1分期肿瘤存在差异。

CTC还可以指导肿瘤分期，CTC计数越高，其分期越高。有荟萃分析显示，外周血CTC阳性与膀胱癌肿瘤分期、组织学分期、转移和局部淋巴结转移相关[5]。这表明，CTC在TNM分期更高的癌症中更容易被检测到。而在其他肿瘤的分期中，CTC已表现出较高的临床价值。美国癌症联合委员会在2010年制订的《肿瘤分期指南》中，首次将CTC列入乳腺癌TNM分期系统，作为一个新的M分期标准，列为cM0(i+)分期，出现在M0和M1之间[19]。cM0(i+)分期定义为：无任何转移性临床症状或体征，无远处转移的临床或影像学证据，但通过分子检测或显微镜检，在循环血液、骨髓或其他非区域淋巴结组织中发现肿瘤细胞或≤0.2 mm的微小转移灶。同时指南认为，cM0(i+)并不改变TNM分期。美国癌症联合委员会第8版乳腺癌分期系统再次肯定了CTC的意义，认为临床晚期乳腺癌患者外周血CTC≥5个/7.5 mL，临床早期乳腺癌患者外周血CTC≥1个/7.5 mL提示预后不良，证据水平为Ⅱ级[20]。

可见，CTC有潜力弥补和完善现有传统膀胱肿瘤TNM分期的不足，通过检测CTC的状态能进一步明确膀胱肿瘤分期，提示早期微转移的存在风险，从而指导临床调整诊疗策略，制订更加合理的个体化诊疗方案(进一步筛查转移、拟定新辅助化疗、辅助化疗方案等)。然而在膀胱癌的TNM分期中，CTC的应用价值尚未见报道。目前缺乏前瞻性研究证明CTC可以帮助临床医师在膀胱癌中进行更精确的TNM分期，有待进一步研究。

2.2治疗 根治性膀胱切除术联合盆腔淋巴结清扫术是MIBC和反复复发的NMIBC治疗的金标准。然而，膀胱切除术对于超过50%的晚期或伴淋巴结转移的患者疗效欠佳[11，21]。大多数发生转移的患者在根治性膀胱切除术后的两年内复发[22]，表明在手术治疗前使用常规分期技术无法检测到早期微转移，而这可能导致膀胱癌的复发[23]。虽然围手术期全身化疗的疗效存在争议，但仍有学者建议将其用于高危疾病复发的患者[24-25]。而CTC的存在与无病生存率、癌症特异性存活率(cancer-specific survival，CSS)和总生存率(overall survival，OS)显著相关，因此CTC不仅可以帮助临床医师选择最适合辅助化疗的患者，而且还可以识别可能仅通过局部疗法治愈的患者，从而减轻医疗负担。此外，CTC是随访或治疗期间疾病监测的重要方式，证实在膀胱癌患者中存在化疗耐药亚群，这可能决定着膀胱癌患者对化疗的反应[26]。同时，CTC已被证明可用于预测卡介苗治疗的高风险NMIBC患者的局部复发时间和进展时间[27]。

Anantharaman等[28]在一项针对转移性膀胱癌患者的研究中发现，肌酸激酶阳性和肌酸激酶阴性CTC中均存在程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)表达，其基因组分析支持其肿瘤起源。该方法强调了CTC亚群的异质分子性质，可能具有临床意义。细胞表面的PD-L1表达可能是CTC能够逃脱免疫监视的一系列分子机制的原因之一。而对于PD-L1+CTC亚群，可以选择使用抗PD-L1免疫疗法[29]。目前尚无明确证据表明，与没有PD-L1表达的CTC阳性患者相比，表达PD-L1的CTC患者可能是更好的免疫治疗候选者。

以上研究表明，检测膀胱癌患者外周血中的CTC可进一步评估化疗和靶向治疗在细胞水平上的疗效，从而有助于指导临床治疗。

而在手术方式选择中，CTC检测也有望发挥更大的诊治价值。目前经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)是治疗NMIBC的金标准，然而Engilbertsson等[30]在研究中发现行TURBT可能会导致癌细胞入血。因此他们建议，应开展经尿道治疗膀胱肿瘤的新技术，最好在可能的情况下将肿瘤整块切除。Blaschke等[31]为了进一步确定TURBT对CTC产生的影响，选取了8例经超声和(或)膀胱镜检查怀疑膀胱癌的患者，在TURBT发生前后立即采集血样，使用CellSearch®系统对每例患者TURBT前后的样本进行CTC计数。结果显示，8例患者中有7例经组织病理学证实为膀胱癌，其中3例患者为T2分期肿瘤，2例患者为T1分期肿瘤，2例患者为Ta分期肿瘤。在2例高级别T2分期肿瘤患者中，CTC在TURBT后可检测到，但在TURBT前不能检测到，其中1例患者存在大量肿瘤细胞扩散；而在所有不同分期低级别肿瘤患者和1例高级别T1分期肿瘤患者中均未检测到CTC，证实TURBT可能导致系统性肿瘤细胞扩散入血，且在高分期和高级别膀胱癌患者中尤为显著。同时该研究提示，临床可通过术前术后CTC检测对比选择更好的手术方式，但还需进一步的大样本前瞻性研究验证。

2.3预后 晚期膀胱癌复发率高、进展快、对化疗反应差以及缺乏新的靶向治疗[32]，因此治疗难度较大。此外，肿瘤的异质性对于肿瘤的治疗也有影响，由于肿瘤的高分子异质性，即使组织学上相似的肿瘤，其治疗结果也存在显著差异[33]。由于缺乏有效的随访方式，特别是缺乏非侵入性诊断、实时治疗反应监测、转移风险评估和隐匿性微转移的早期检测，晚期膀胱癌患者的预后往往更差。

膀胱癌根据肿瘤是否侵犯肌层，分为NMIBC和MIBC。其中，NMIBC占75%以上[34]。虽然NMIBC被认为是一种非侵袭性肿瘤，但其复发风险高达78%，进展风险高达45%，保守治疗及保留膀胱治疗后的癌症死亡率为16%～23%[31]。为了研究CTC检测在NMIBC患者中的潜在预后价值，Gazzaniga等[18]证实，CTC的存在与疾病复发的时间相关。在44例NMIBC患者中，有8例检测到CTC，平均首次复发时间为6.5个月，而在未检测到CTC的患者中，平均首次复发时间为21.7个月(P<0.001)；8例CTC阳性的患者中有7例在24个月的随访中局部复发并进展为MIBC，而36例CTC阴性的患者，只有13例局部复发，且没有进展为MIBC。这表明，CTC计数与预后相关，计数越高，提示预后越差。因此通过CTC检测，能够帮助患者更早发现膀胱癌的复发及进展，从而更及时地实施疾病的治疗和监测。

高级别T1分期膀胱癌是NMIBC的最高风险亚型，其5年复发率接近40%，5年进展率为20%[35]。然而，目前没有特异性标志物能预测高级别T1分期膀胱癌的复发、进展和CSS。一项单中心前瞻性研究通过长期随访调查102例高级别T1分期膀胱癌患者外周血中CTC对CSS和OS的影响发现，即使是单个CTC存在也可以预测较低的CSS和OS，其中位随访时间为63个月[21]。该研究提示通过CTC检测可识别超高风险NMIBC患者，故可对其进行更密切的随访，早期进行根治性手术甚至全身治疗，从而改善患者预后。

有研究显示，外周血CTC阳性与膀胱癌患者较差的OS、无进展生存率/无病生存率相关，提示外周血中CTC的存在是膀胱癌患者预后不良的独立预测指标[5]。这证实了CTC用于监测远期转移进展膀胱癌患者术后的价值。另外，Abrahamsson等[11]首次证明了CTC的存在与18F-脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描放射性转移性疾病的风险增加有关，且与根治性膀胱切除术治疗的晚期膀胱癌患者的早期进展相关。

因此，CTC与膀胱癌进展及复发有关，可作为临床上初步判断膀胱癌患者的预后指标。

3 小 结

CTC检测因具有微创、快速、便捷、特异性高等优点，在膀胱癌的诊疗中已逐步开展并发挥巨大潜力。然而目前各种检测CTC的方法总体敏感性偏低[5]，不能用于膀胱癌的早期筛查，且各种CTC检测方式的价格均较高，这限制了CTC在临床的广泛运用，故需进一步开发价格低廉、敏感性和特异性较高的技术。

研究发现，与其他癌症循环生物标志物相比，CTC作为游离DNA可以更好地预测总体生存率[36]，在帮助早期干预、治疗决策和治疗反应评估方面具有巨大的应用价值[37]。且据文献报道，CTC和循环肿瘤DNA可能在预后和转移评估中具有互补作用[36]。因此，两者的共同检测在未来膀胱癌的诊疗中或许能发挥更大的作用。虽然目前在膀胱癌的诊疗中尚缺乏运用CTC检测的大规模临床前瞻性研究，但相信随着对CTC多种检测方法统一的评价标准和严格的标准化质量控制系统的建立，CTC检测将在膀胱癌诊疗甚至临床个体化医疗的推广应用中具有更大的发展前景。