社区获得性呼吸窘迫综合征毒素与肺炎支原体感染喘息的关系研究进展

林诗惠综述 欧维琳审校

肺炎支原体(MP)是引起呼吸道感染的常见病原，3～15岁儿童的社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)中8%～40%由MP感染引起，MP呼吸道感染临床表现呈多样性，可以从无症状到鼻咽炎、鼻窦炎、中耳炎、咽扁桃体炎、气管支气管炎、细支气管炎和肺炎等。喘息是MP所致细支气管炎的主要表现，婴幼儿支原体肺炎(MPP)者喘息症状较年长儿明显。MP 感染还与哮喘样急性发作相关，有31%～50%MP感染者会出现哮喘样急性发作[1]。MP感染的致病机制尚未完全明确，已经发现MP的P1和P30黏附蛋白具有直接细胞毒性反应，内源性活性氧及过氧化物、脂蛋白也是重要毒力因素。近年来研究发现，社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDS TX)是MP表达的一种新型毒力蛋白，在MP致病机制中发挥着主要作用，本文从CARDS TX的结构功能、致病机制方面与MP感染相关性喘息研究进展进行综述。

1 CARDS TX概述

2005年kannan等[2]在研究各种宿主蛋白作为支原体表面寄生的靶点时，发现了一种名为MPN372的支原体多肽，它具有ADP-核糖体化(ADP-ribosyltransferase，ADP-RT)和空泡化活性，并将其命名为CARDS TX。它可以与肺表面活性剂的主要成分表面活性蛋白A(SP-A)和膜联蛋白家族成员中的AnxA2(Annexin A2)结合，并利用网格蛋白内吞机制进行内化，发挥一系列的细胞毒性作用。

2 CARDS TX的结构功能

2.1 CARDS TX的分子结构 CARDS TX 由17个α螺旋和43条β链组成，具有功能上可分离的N-末端和C-末端结构域。N-末端的D1结构域(D1)和C-末端的D2、D3结构域(D2、D3)折叠成等腰三角形排列。

2.1.1 CARDS TX的N-末端结构域：CARDS TX 的N-末端为单抗ADP核糖转移酶(mono-ADP ribosyltransferase，mART)，具有与NAD结合能力和ADP-RT活性。研究发现[3]，CARDS TX通过与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性反应体共定位，并催化NLRP3的ADP-核糖化来激活NLRP3炎性反应体，释放IL-1β。IL-1β决定了一系列炎性相关疾病炎性反应的严重程度，还可加重变态反应性疾病，如过敏性哮喘[4-5]。载脂蛋白E(ApoE)通路可通过抑制NLRP3炎性小体的激活和氧化应激而负向调节过敏性气道炎性反应，靶向ApoE通路可能是治疗哮喘等过敏性气道疾病的新途径[6]。CARDS TX与N端肽结合可产生功能性IgE诱导肥大细胞脱颗粒，引发哮喘样疾病[7]。

2.1.2 CARDS TX的C-末端结构域：CARDS TX C-末端的β-三叶结构域与CARDS TX的细胞表面受体识别、结合及内化有关，并且C-末端区域以类似全长毒素的方式诱导空泡化。研究数据表明[8]，CARDS TX与磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)的结合能力高于其他膜脂，将C-末端的20个残基截断后发现，这种特异性结合功能消失，这说明受体的结合部位位于D3。C末端除了具有致细胞空泡化、ART活性的必要结构，还具有多个抗原表位，使CARDS TX具有较强的免疫原性。

2.2 CARDS TX的氨基酸结构 CARDS TX是一种由591个氨基酸组成的毒力因子，与百日咳毒素(PT)的S1亚基(PT-S1)和霍乱毒素(CT)的催化结构域有同源性。这3种毒素的mART结构域都具有DT亚组(CTxg)ADP核糖基化毒素的特征性R-STS/T-E信号基序。N-末端的精氨酸(R10)和中间区丝氨酸—苏氨酸—丝氨酸(S49-T50-S51)氨基酸序列与NAD+定向结合，而催化性谷氨酸(E132)负责转移酶活性。但CARDS TX ADP-RT序列却不同于其他细菌的mART结构域，94-126残基形成螺旋链构成D1。因此，CARDS TX除了具有ADP-RT活性外，还可诱导细胞空泡化、黏膜细胞脱落和纤毛丧失。野生型(WT)和半胱氨酸到丝氨酸突变型CARD毒素的硫醇实验发现，半胱氨酸氨基末端残基C230和C247形成了二硫键(DT)，DT对CARDS TX的构象稳定性和功能活性的保存至关重要[9]。

3 CARDS TX的致病机制

3.1 参与细胞膜表面黏附 细胞黏附是MP定植的关键步骤。CARDS TX可以与SP-A和AnxA2结合，使MP黏附于宿主细胞。在同时表达AnxA2和SP-A的NCI-h441细胞转染AnxA2 siRNA后，AnxA2和SP-A的表达明显减少，并且发现CARDS TX的结合能力及细胞空泡化作用与AnxA2及SP-A的表达呈正相关。研究表明，SP-A比AnxA2的表达更占优势，SP-A更易于作为结合靶标。但AnxA2作为CARDS TX结合和内化的独特受体，CARDS TX可选择性地与AnxA2结合，并在内吞和转移的早期阶段调节膜动力学，增强CARDS TX的空泡化作用，且AnxA2抑制剂可阻断此过程。MP感染后寄生在呼吸道黏膜表面，并繁殖于黏膜细胞，可释放过氧化氢和核酸酶等物质，诱导纤毛退化及葡萄糖代谢、氨基酸摄取和蛋白质合成的生化损伤，造成呼吸道上皮细胞坏死、病变等[10]。此外，P1黏附素介导的细胞黏附在MP中具有独特性[11]。

3.2 内化至细胞内 CARDS TX必须与宿主受体细胞AnxA2和SP-A受体结合后，利用网格蛋白介导途径内化，然后转运到特定的细胞内才能发挥ADP-RT和空泡化活性。其内化方式与白喉毒素(diphtheria toxin，DT)类似，毒素被翻译成一个单一的多肽链，通过网格蛋白途径被内吞。CARDS TX在内化作用时可产生氧自由基导致细胞损伤和结构恶化。

3.3 细胞内运输 CARDS TX从早期内涵体运输到晚期内涵体，然后利用其独特的KELED序列通过逆向运输(高尔基体中间室到达内质网)以发挥毒素的致病作用。CARDS TX的逆向转运对NLRP3 ADP-RT介导的IL-1β分泌及诱导之后的液泡形成至关重要。KELED序列位于D1和D2、D3结构域之间的接头处。研究发现[8]，D1与D2、D3之间主要是极性连接，表明该界面可以被破坏，这能否成为靶向治疗位点有待研究。

3.4 诱导细胞内空泡化 CARDS TX诱导的特征性空泡化可导致纤毛运动减退和呼吸道上皮细胞完整性丧失，引起细胞死亡。CARDS TX诱导形成的泡液与幽门螺旋杆菌Vac A均呈酸性，但Vac A需要在酸性或弱碱存在下才能诱导酸性空泡形成[12]，CARDS TX则不需要。研究还发现，CARDS TX的泡液来源于晚期内涵体，通过GTP结合蛋白Rab9(Rab9 GTPases)介导内吞途径实现空泡化作用。液泡ATP合成酶(V-ATPase)抑制剂bafilomycin A1和离子载体monensin可通过阻止早期内涵体的内吞途径抑制液泡的形成。AnxA2不仅介导CARDS TX结合，而且还作为CARDS TX ADP核糖化和空泡化事件的关键介质。纤溶酶是一种具有促炎活性的蛋白酶，气道平滑肌(ASM)细胞可将纤溶酶原裂解成纤溶酶。纤溶酶原以AnxA2调节的方式刺激ASM细胞因子的产生，在哮喘病理生理学中具有重要意义，靶向AnxA2介导的信号转导可能为治疗慢性哮喘等疾病的气道炎性反应提供一种新的治疗方法。

4 CARDS TX与MP感染喘息的关系

气道炎性反应是喘息性疾病发生的本质，而过度炎性反应是MP所致儿童呼吸道感染的病理生理基础。与SP-4肉汤培养相比，CARDS TX mRNA的表达量在哺乳动物中明显增高。CARDS TX可以解释MP感染相关的细胞病理学和炎性反应[13]，并且与MP感染喘息的发病、发展及喘息持续状态存在关系。

4.1 CARDS TX与MP感染喘息的发病相关 MP是婴幼儿喘息最常见的病原体之一，初发喘息和反复喘息的患儿MP感染率和血清IgE水平均显著高于非喘息患儿[14]，这表明MP感染与婴幼儿喘息密切相关。Medina等[7]发现，CARDS TX足以在BALB/CJ小鼠中诱导哮喘样疾病，其发病机制是CARDS TX通过Balb/C信号通路产生IgE，发生肥大细胞脱颗粒，导致气道高反应性。Ye等[15]研究认为，产生这种过敏原特异性IgE是MP的黏附素P1蛋白，P1特异性IgE阳性的MP肺炎患者体内表现为IL-4、IL-13、CCL17和CCL22的表达增加，Th0细胞过度分化为Th2细胞。这表明针对蛋白质的抗体对宿主防御肺炎支原体很重要，也对靶向疫苗的开发具有重要的作用[16]。总之，CARDS TX在体内具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒细胞增多，T细胞和B细胞积聚，产生相应的自身抗体，同时释放各种细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ (IFN-γ) 及多种白介素(IL)，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-17等细胞因子[17-18],对T细胞亚群Th1/Th2比例产生破坏，表现为Th2细胞炎性反应增强，导致黏液化生和气道高反应性增加，肺功能下降，以气道阻力增加和肺顺应性降低为特征。

4.2 CARDS TX与MP感染喘息的加重相关 有学者用CARDS TX抗原捕获PCR和P1黏附素PCR反应来检测MP，以评价哮喘患儿体内MP的抗体反应及对哮喘控制情况的影响。研究发现，MP的检出率与哮喘病情加重有关，并且推测，这可能与哮喘患儿对MP的体液免疫应答较差有关，导致急性哮喘患儿有较高的MP感染率[19-20]。持续MP感染可产生大量CRP、乳酸脱氢酶(LDH)、铁蛋白等炎性标志物，可加重喘息性疾病，且CRP、LDH和黏液栓的存在，与难治性MPP患儿胸片浸润影的消失时间有关[21-22]。气道内MP水平较高时(MP高负荷)，其患儿的肺外表现、肺实变、胸腔积液及过敏史、空气变应原试验阳性、血清IgE、ECP升高的比例均明显升高，表现为肺泡灌洗液(BALF)中IL-4水平明显升高[23]。一项对Th17与MPP关系的研究得出，过度的Th17细胞反应可能是持续感染期间免疫病理损伤的原因，miR-29c/B7-H3/Th17轴在MPP患儿过度炎性反应中起重要作用[24]。哮喘患儿病情加重与IgM水平直接相关，有MP抗体IgM阳性的哮喘患者显著增加了1年再入院的机会，并且CARDS TX IgM 向IgG的转换过程中，不仅加强了CARDS TX在气道感染期间的合成和检测，而且提高了CARDS TX引发强烈免疫原性反应的能力[25]。以上均可能是MP感染与喘息性疾病加重密切相关的原因。

4.3 CARDS TX与MP感染喘息持续状态密切相关 MP可以在呼吸道中存在较长时间，即使在使用适当的抗生素治疗后，MP仍会在呼吸道中持续数月并保持传染性，这与发展为喘息持续状态密切相关。单次暴露于CARDS TX足以在体内引起长时间的过敏性炎性反应，并且炎性峰值的时间与CD4+T细胞相关的肺顺应性下降程度有关联，MP感染的哮喘患儿在稳定期气道T淋巴细胞免疫功能明显下降，表现为CD4+/CD8+比值显著降低，这可能与哮喘在MP感染后出现喘息持续状态有关[26-27]。并且，低水平的MP无法有效地诱导PGE2而下调过敏反应，从而维持甚至加重哮喘气道的过敏性炎性反应。研究发现[28-29]，MP可在病原体表面形成一层生物膜，随着生物膜的成熟，CARDS TX水平下降，但耐药性也随之增加，更不容易被抗生素抑制和补体杀伤。在难治性哮喘患儿呼吸道分泌物能检测到CARDS TX，相对于CARDS TX阴性的患儿疾病难以控制，生活质量较差。此外，TNF-α也与持续复发性喘息风险密切相关[30]。韩国一项观察性研究发现[31]，只有一小部分患儿在MPP后出现反复喘息发作(RWE)，RWE患儿在初次MP感染时出现喘息的可能性更大，然而在MP肺炎流行期住院的RWE患儿并没有增加，这是因为MP再感染在儿童中很少见，包括反复喘息发作的患儿或哮喘患者。

综上所述，CARDS TX作为MP的致病毒素，一方面通过ADP-RT活性来激活NLRP3炎性反应体，引起一系列的炎性反应；另一方面利用毒素的空泡化作用引起纤毛运动减慢及呼吸道上皮细胞完整性的破坏，与喘息的发生、加重及持续状态密切相关。对于结构功能方面与MP感染的喘息研究较少，仍需进一步研究，有望对MP感染伴喘息性疾病诊治提供实验室依据，对于MP感染相关性喘息的治疗及研发CARDS TX的靶向药物提供新的思路。