流式细胞术检测急性白血病微小残留病的应用价值

曹 琳 宋镜南

信阳职业技术学院，河南省信阳市 464000

急性白血病(AL)是发生在造血干细胞水平上的恶性肿瘤，按照其分化的系别不同，分为急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)两大类[1]。AL 诊断时体内白血病细胞总数约1012，诱导化疗达到完全缓解后，白血病细胞总数 <109，这种体内残存的少量白血病细胞称为白血病微小残留病(MRD)。AL在现有治疗技术下完全缓解率明显增加，但仍有一些患者出现复发的情况[1]。治疗过程中的定期监测有助于对化疗敏感度及整体治疗情况的评估。既往常通过对骨髓细胞的形态学观察评估病情，然而这种方法的敏感性和特异性均有限，可能会由于对残留疾病的错误评估而出现过度治疗或治疗不足的情况。因此，需要更准确和特异的方法来检测残留白血病细胞。

1 流式细胞术检测MRD的优势

检测残存白血病细胞，需要在患者发病时找到该患者白血病细胞的特异标志，包括遗传学、分子学及免疫学的特征。这些特征往往是正常血细胞所没有的，因此利用这些标志可与正常细胞进行鉴别，特异地识别白血病细胞。

1.1 荧光原位杂交技术(FISH) FISH使用染色体或基因特异核酸探针检测染色体数目或结构的异常，可对特异的 DNA 序列进行分析。但该方法仅适于部分具有特殊遗传学特征的白血病细胞，灵敏度仅为 10-2～10-3。FISH方法虽可明确初诊时白血病细胞染色体数量或结构上的改变，但敏感性较低，检测结果受分裂相多少的影响。若与其他技术结合亦可提高其灵敏度[2]。Wang等[3]将流式细胞术与FISH结合，对AML患者先利用流式细胞仪筛选出CD34+CD38-细胞，再对分选细胞进行FISH，荧光显微镜下分析FISH+CD34+CD38-细胞(白血病干细胞)的比例，此方法富集白血病细胞后再应用FISH检测MRD，可提高白血病细胞的检出率。

1.2 聚合酶链式反应(PCR) PCR技术通过在体外大量扩增特定的DNA片段，再对扩增后片段进行检测。应用 PCR检测ALL 患者 MRD 时，常采用免疫球蛋白(Ig)和/或 T 细胞受体(TCR)基因重排序列作为标志。ALL 白血病细胞起源于单个早期病变淋巴细胞，大多数具有克隆性 Ig 基因和/或 TCR 基因重排，因此可通过IgH、IgK、TCRαβ、γδ等标志物检测MRD。约 90% 的ALL 儿童患者的MRD可通过重排基因进行检测，该方法敏感性达10-4[4]。实时荧光定量PCR(RQ-PCR)通过实时测定PCR产物上的荧光物质，可实时检测PCR产物，灵敏度可达到10-6，是目前检测MRD灵敏度最高的方法。RQ-PCR可对含有融合基因(PML/RARa、AML1/ETO、CBFβ/MYH11)、突变基因(FLT3、NPMl)和异常表达基因(WT1)的白血病亚型进行 MRD 检测，通过对异常基因检测的高度敏感性，可将白血病细胞与正常细胞区分。但是仅有约 40% ALL和30%的AML具有异常的分子生物学标记[5]，对其余多数无分子生物学异常标记的患者并不适用。而对于具有异常分子标记的AL中，由于PCR产物的数量与白血病细胞数量之间没有明确的比例关系，因此只能对残存的白血病细胞进行定性监测，无法做出精确评估。此外，白血病细胞的分子标记的不稳定性也为检测增加了难度。在白血病治疗或复发过程中，分子标记可能发生变化，使PCR技术出现漏检，不仅增加了结果的假阴性率，也需要探索新的分子标记[2]。

1.3 流式细胞术(FCM) FCM检测急性白血病微小残留病是利用白血病细胞上白血病相关的免疫表型(LAIP)的表达与正常细胞的区别，从而成为区分白血病细胞和正常细胞的一种技术方法，可对检测的细胞进行快速多参数的定量分析，灵敏度达10-4～10-5[6]。多色 FCM 是检测 ALL-MRD 的方法之一，可从104或更多正常细胞中检测出1个白血病细胞， 3、4种荧光FCM 的引进增加了FCM检测的灵敏度和适用范围[7]。目前已扩展到6～9色标记，多色标记可以提供LAIP的多项指标，降低了识别难度，大大提高了 MRD 检测的灵敏度、准确度及适用性[4]。FCM可对LAIP进行检测，不受分子生物学异常的影响，对残留白血病细胞进行准确定量，比PCR技术更直观，应用更广泛[8]，现已成为检测 MRD 最有前景的一种方法。

2 FCM对MRD的免疫学检测

随着多色荧光的使用，FCM对MRD的检测更快速准确。但早期由于对细胞单克隆抗体标记物的认识较少，限制了MRD的免疫学研究发展。例如TdT和CD10不仅在大多数淋巴母细胞瘤细胞中表达，也可出现在正常前体B细胞中。因此不能使用TdT和CD10对骨髓中的异常细胞进行甄别[9]。然而白血病细胞上的LAIP与正常细胞具有明显的差异，可据此区分出白血病细胞。LAIP主要包括表达跨系列或交叉系列抗原标志、跨期或不同期的抗原共表达、抗原表达量的异常、散射光异常等4种类型。例如，在一些B-ALL和AML中可表达CD34/CD19/CD20和CD34/CD56，这些免疫表型组合在正常细胞中极少表达。CD3/TdT除了在胸腺中发育的T细胞有所表达外，在其他正常造血细胞中几乎无表达，因此可将CD3/TdT作为判断T-ALL的一项参考指标。

目前，FCM诊断MRD的方法主要有两种[7，10]，第一种是在初发时确定急性白血病的类型，筛选出LAIP，并在缓解后以该LAIP监测残留的白血病细胞。在此方法中，缓解后阳性细胞的量与在诊断时检测量的比较对于临床诊断及预后判断有重要的价值。另一种方法是先根据正常骨髓标本抗原表达情况建立阴性的双轴点图，若抗原出现在阳性区域范围内即可反映其异常表达。正常的骨髓细胞和白血病细胞若显示表达相似的免疫抗原，可以通过它们的数量差异来区分。例如在一些B-ALL病例中，在CD19阳性的细胞中可出现CD10和CD34的过表达、CD45和CD38的失表达[11]。

2.1 T-ALL 几乎所有的T-ALL均表达TdT和泛T标志(CD2、核质CD3、CD5、CD7)等。CD34抗原在T-ALL阳性比例在30%左右，可用于TdT表达较弱或阴性的病例。通过使用CD19和MHC-Ⅱ标记，可以进一步增强T-ALL细胞的检测，这些标记在大多数正常骨髓TdT+细胞上都有较强的阳性表达，但在T-ALL细胞上的表达为阴性。

2.2 B-ALL B-ALL的MRD检测较为复杂，需要使用较多的抗体组合。CD19、CD10、CD34或TdT的同时表达通常用于识别不成熟的B细胞。在近30%的病例中，抗原表达的数量差异也可用于区分白血病细胞和正常细胞。CD38、CD45和CD22在正常的未成熟B细胞和白血病细胞中均有不同量表达，也可通过对髓系和NK相关分子的抗体检测到区分正常细胞和白血病细胞。结合以上这些免疫表型可以检测高达85%的B-ALL，敏感度达到10-4[12]。

2.3 AML 据报道[13]，约2/3以上的AML病例发现免疫表型的表达异常，但这些异常的免疫表型在MRD检测中的敏感性尚不清楚。CD34/CD56这两种免疫抗原在近20%的儿童AML中同时表达，且与t(8;21)(q22;q22)相关，且此组合的灵敏度可以达到10-4，是目前较为适合MRD检测的抗原组合。由于70%～80%的AML患者表达CD87，而在正常CD34+细胞中仅表达0.2%，因此CD34和CD87是另一种可能有用的组合[14]。

3 总结和展望

近期前瞻性研究报道[15]，MRD的评估是影响儿童期ALL治疗结果的独立预后因素。治疗早期MRD的检测对疾病的预后有预测价值。因此在西方国家，几乎所有的儿童ALL患者和大部分成年ALL患者都会进行MRD监测用于区分不同的危险度和评估治疗效果[12]。随着多色流式细胞仪的发展，FCM 检测 MRD的准确性和灵敏度均有很大的提升。FCM的应用范围广，但其结果会受到设门方式、抗体组合、操作者技术水平等多方面的影响，不同实验室之间检测结果有差异，且缺乏统一标准。目前白血病治疗已经进入MRD时代，MRD检测的重要性已经得到充分的证实，因此在今后的临床研究中，MRD检测将对白血病的治疗和预后判断有着重要的意义，也将成为FCM在血液学应用的重要部分。