细胞程序性死亡在血管平滑肌增殖中的研究进展

芮博文，颜 竞，杨平珍

南方医科大学珠江医院 心血管内科，珠江医院心脏中心实验室，广东广州 510515

细胞会通过调节自身的存活或死亡维持自身稳态，这个过程被称为细胞程序性死亡，如凋亡、自噬、焦亡、铁凋亡等。凋亡是人们最早发现的一种细胞程序性死亡方式，是存在于细胞中的自毁机制。这个过程机体能清除衰老及异常细胞，并在维持很多细胞功能方面有重要作用。现有的研究发现凋亡与血管平滑肌相关疾病存在重要联系[1]。自噬在细胞维持内稳态扮演着至关重要的作用，通过降解细胞内成分供细胞更新细胞器及蛋白[2]。近年来兴起研究的热点焦亡、铁凋亡[3]在对细胞生存也起着至关重要的作用。细胞焦亡是一种调节细胞死亡的促炎性形式。研究发现焦亡在形态学、机械学和病理生理学上都不同于其他形式的细胞死亡，焦亡可能与动脉粥样硬化等血管平滑肌相关疾病存在密切关系。铁凋亡是一种非凋亡形式的细胞死亡，可由脂质活性氧的积累和质膜多不饱和脂肪酸的消耗，触发铁凋亡，导致细胞死亡[4-5]。现有的研究发现铁凋亡在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)生命周期中存在重要的调控作用。

1 细胞凋亡及其在血管平滑肌增殖中的作用

细胞凋亡是第一种被人们发现的细胞程序死亡方式，也是公认的各种生命活动过程中的重要组成部分，广泛存在于各种多细胞生物中。在形态学上对凋亡进行研究，目前已经鉴定出细胞凋亡过程中发生的各种形态变化。在细胞凋亡过程中，通过光镜可以看到细胞典型的收缩和萎缩现象[6]。凋亡作为一种独特、重要的程序性细胞死亡模式，涉及到基因决定的细胞清除，其发展过程受到许多基因调控，如广为人知的Bcl-2家族[7]、Caspase家族、抑癌基因p53等。人们通过对细胞凋亡的研究，对其机制有了一定的了解，目前仍有许多发现补充完善凋亡的机制。

研究发现凋亡在调节VSMC增殖中起重要作用。正常状态下VSMC的增殖和凋亡保持平衡以维持细胞的数量，在外界刺激等因素打破平衡后，将会导致血管平滑肌细胞的异常增殖或死亡，造成病变的发展。在病变早期阶段，凋亡受到抑制，血管平滑肌的增殖将造成冠状动脉粥样硬化、血管再狭窄等现象的发生[8]；但病变晚期，斑块中血管平滑肌细胞产生分泌胶原蛋白可以提高斑块的强度，对斑块的稳定性是有益的和必要的，细胞凋亡会造成VSMC减少，导致斑块的不稳定及钙化发生[9]。

近年来的研究发现生物节律、ncRNA等可调节凋亡对血管平滑肌增殖中的作用[10]。一方面，研究发现miR-96-5p过表达靶向调节NFAT5促进血管平滑肌细胞的凋亡从而抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖[11]；Wang等[12]发现lncRNA FOXC2-AS1通过miR-1253/FOXF1信号轴促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，加快了动脉粥样硬化的发展。另一方面，Chen等[13]的研究发现环境污染物——丙烯醛通过lncRNA NEAT1和Bmal1/Clock的下调诱导VSMC凋亡，而芦笋提取物减轻了丙烯醛引起的促凋亡反应和昼夜节律紊乱，达到稳定粥样硬化斑块的作用；褪黑素是一种调节时差、促进睡眠等多种功能的激素，Lee等[14]的研究发现褪黑素通过Sestrin介导的抑制mTORC1和ROS清除作用来控制VSMC的增殖和凋亡，达到稳定斑块的作用。因此探究在VSMC增殖中，生物节律、ncRNA等调节细胞凋亡的作用机制，不同时期凋亡在血管平滑肌增殖中对病变组织转化、效果及疾病预后的研究仍极有意义。

2 自噬及自噬流对血管平滑肌增殖的意义

2.1 自噬及其对血管平滑肌增殖的作用 自噬是一个通称，是指所有通过将细胞质物质输送到动物细胞的溶酶体或植物和酵母细胞的液泡中的途径[15-16]。自噬作为维持细胞内环境稳定的重要机制在真核生物中广泛存在并发挥了不可替代的生理作用。在自噬发生过程中有多种蛋白参与，包括 Atg[17]、LC3、P62[18]等，其中 LC3(light chain 3)是目前公认的自噬标志物，LC3蛋白经合成修饰后形成LC3-Ⅱ并紧密结合于自噬体膜上；P62/SQSTM1蛋白是公认的自噬相关蛋白，其可以将细胞质的成分标记，进入自噬体中进行降解[18]。因此P62蛋白也是评估自噬水平的重要指标之一，通过综合分析这些蛋白的表达即可评估自噬流的通畅程度。

在生理状态下，自噬可以有效抑制血管平滑肌细胞增殖，而病理状态下自噬过度激活及水平不足均会导致血管平滑肌的异常增殖。通过研究发现自噬对血管平滑肌存在两种截然相反的作用：1)自噬抑制血管平滑肌细胞增殖，通过将人肺动脉血管平滑肌细胞的LC3B基因敲除后，经缺氧处理可见平滑肌增殖增加，从而证实了自噬在其中发挥了保护性作用[19]；2)自噬促进血管平滑肌细胞增殖，文献报道当外界刺激时VSMC自噬提高，自噬水平的提高加速了蛋白质和细胞内细胞器降解的速度，加速了血管平滑肌表型转换及增殖的发生，促进动脉粥样硬化[20-21]，而通过抑制自噬可阻止TNF-α诱导的表型转换[22]。越来越多的证据表明，在许多病理状态下血管平滑肌受细胞因子(如PDGF、TGF-β等)刺激由收缩表型转换为分泌表型，其中分泌表型具有较强的增殖迁移能力，易导致血管狭窄，顺应性下降，而在这些发展过程中通常可以观察到细胞内自噬水平的改变。

2.2 自噬流在血管平滑肌增殖中的作用 既往的研究中往往从自噬体的水平对自噬的评价，但单从自噬体角度并不能反映自噬水平；自噬作为一个动态变化的过程，其包括了自噬体的诱导、形成、运送以及降解，我们将这自噬发展的整个过程称为自噬流。从自噬流角度分析，自噬水平的评价应包括自噬体的形成和清除，即除了对自噬体进行检测还应包括对自噬流的通畅程度进行检测[23]。目前对自噬流及其通畅程度的研究多集中于肿瘤细胞、神经细胞及心肌细胞等细胞中，在这些研究中发现自噬流的通畅对维持细胞内环境稳定及其生理状态起到至关重要的作用。

结合目前的研究，自噬流的通畅将是以后研究的方向之一[24]。Yin等[25]对以往神经细胞的研究总结发现自噬流的通畅对细胞正常状态保护极为重要；在血管平滑肌中的研究目前主要涉及到血管的钙化，研究显示当自噬流不通畅时，可见血管钙化明显增强；改善血管平滑肌细胞自噬流的阻塞状态可以抑制高糖环境导致的血管钙化[26]。但目前自噬流与血管平滑肌细胞增殖的研究较为缺乏，可以作为今后的研究方向。

目前研究对血管平滑肌增殖模型的建立多采用PDGF[27]、AngⅡ[28]等处理细胞。PDGF-BB诱导血管平滑肌细胞自噬增强，促进细胞发生表型转换、增强了细胞增殖及迁移能力，而细胞经PDGF-BB及自噬抑制剂共处理后可明显抑制血管平滑肌增殖[29]。当采用AngⅡ构造VSMC增殖模型时，研究表明其激活了细胞内多条信号通路且在实验过程中可以观察到AngⅡ刺激后LC3-Ⅱ表达升高、P62蛋白降解。对于AngⅡ对自噬的作用机制，当下有实验证据表明AngⅡ可能通过激活ROS来激活自噬[30]。结合以前研究表明AngⅡ促进血管平滑肌增殖的机制中就包括氧化应激，这与AngⅡ诱导自噬相互印证。

3 细胞焦亡及其对血管平滑肌增殖的作用

细胞焦亡也叫细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，作为近年来新发现的一种细胞程序性死亡方式[31-33]，是机体的一种重要的天然免疫反应，备受关注。研究发现细胞焦亡的分子生物学特征是由Gasdermin D介导的细胞程序性坏死，可分为依赖半胱天冬酶-1(Caspase-1)的经典途径及半胱天冬酶-4、5、11(Caspase-4，5，11)的非经典途径[34-35]。最新的研究发现Caspase-8也可以裂解并激活Gasdermin D，从而诱导细胞焦亡[36-38]。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。

许多研究发现可以通过细胞焦亡抑制各种癌细胞的增殖和迁移[39]。目前对血管平滑肌细胞焦亡的研究较少，Li等[40]研究发现VX-765通过抑制Caspase-1，抑制VSMC在动脉粥样硬化形成过程中的焦亡作用从而稳定斑块。这提示细胞焦亡可以影响血管平滑肌状态，PCI术后再狭窄的发生中炎症反应诱导了血管平滑肌细胞增殖及迁移，而细胞焦亡作为细胞死亡的炎症反应之一，推测细胞焦亡与血管平滑肌细胞的增殖有一定联系，探究细胞焦亡与血管平滑肌细胞增殖的关系也是今后的研究方向之一。

4 铁凋亡对血管平滑肌增殖的调节

铁凋亡是近年来发现的一种由铁依赖的氧化损伤引起的细胞死亡模式，是近年来发现的一种细胞凋亡的调节形式[41-42]。其形态学特征是细胞质和脂质活性氧增多、存在比正常线粒体小的线粒体、线粒体膜密度浓缩、线粒体嵴减少或消失、外线粒体膜破裂等。目前的研究表明Erastin[43]、RSL3、RSL5[44]、Buthioninesulfoximine[44]等 多 种化合物可以诱导铁凋亡的发生。综合目前的研究，许多的证据指出铁代谢和脂质过氧化信号是铁凋亡的中心环节，当细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)直接或间接受到谷胱甘肽(GSH)水平降低的抑制时，导致铁依赖性脂质过氧化的累积，并最终导致铁凋亡的发生[45]。过量的铁离子可以通过Fenton反应产生ROS，进而诱导铁凋亡的发生；通过研究发现铁螯合剂(去铁胺、甲磺酸去铁氧胺、环吡酮奥拉明)通过降低铁过载可以抑制Erastin介导的铁凋亡[43]；当额外的外源性铁源(如柠檬酸铁铵、柠檬酸铁等)则可以促进Erastin诱导的死亡[46]。在白血病细胞的研究中发现JNK和p38对Erastin诱导的细胞死亡也起到了重要作用，SP600125(JNK磷酸化抑制剂)和SB202190(p38活化抑制剂)可以抑制Erastin诱导的铁凋亡[47]。

当前对铁凋亡在血管平滑肌中作用的研究较少，根据已有的研究，香烟烟雾提取物以剂量和时间依赖的方式诱导血管平滑肌细胞死亡，通过特异性的铁离子抑制剂或铁离子螯合剂完全消除，进一步研究表明胞内谷胱甘肽的耗竭是诱导血管平滑肌细胞铁凋亡的主要原因之一[48]。该研究表明铁凋亡过程不仅存在于肿瘤细胞、心肌细胞、神经细胞，在血管平滑肌细胞中也存在，并且对疾病的发生及转归有重要影响。

5 展望

目前对血管平滑肌增殖的研究中，与凋亡相关的研究有一定的基础，但凋亡的发展与调控仍具有较多疑问，而且凋亡程度在疾病发生过程中的动态变化及对疾病的影响仍然不明确，因此对细胞凋亡的研究仍然有意义。而目前涉及自噬、焦亡、铁凋亡的相关研究较少。当前研究发现自噬与血管平滑肌细胞的关系是复杂的，自噬既可以抑制又可以促进血管平滑肌细胞增殖。现有的研究结果显示自噬底物及触发条件的不同，导致的生物学效应也不同；自噬的调节机制、如何诱导细胞选择性自噬达到抗增殖的目的都需进一步研究。现在自噬流在其他细胞中作用的相关研究启发我们从自噬流角度动态进行研究。结合以往研究中自噬的双重效应，提示在抗增殖作用中自噬流的通畅程度也许更为重要。而调节自噬流的具体机制及对血管平滑肌细胞的具体影响需要进一步研究。细胞焦亡作为一种细胞炎性死亡方式，广泛存在于各种细胞中。深入研究凋亡的信号机制，目前主要为Caspase-1的经典途径及Caspase-4、5、11的非经典途径，促进细胞死亡，抑制细胞增殖及迁移能力，但目前焦亡在血管平滑肌细胞中的研究较少，具有进一步研究的价值。铁凋亡作为新发现的一种细胞凋亡过程，具有重要意义；铁凋亡通过铁代谢、脂质过氧化、MAPKs家族蛋白(ERK、p38和JNK)调节，在血管平滑肌相关疾病的发生、脂质代谢异常、MAPKs蛋白的激活中起着重要作用，这提示着我们铁凋亡也许在这些疾病中起到了重要的作用，铁凋亡在动脉粥样硬化、血管再狭窄等疾病中的作用有较高的研究价值。血管平滑肌细胞中这些细胞程序性死亡之间的相互作用，缺乏研究证据，深入研究将更好地阐述各细胞程序性死亡与血管平滑肌细胞增殖的关系，为临床治疗提供新的指导意见。