骨髓间充质干细胞及其外泌体治疗椎间盘退变的研究进展

张晓勃，施锦涛，张凯，胡一村，王克平，周海宇*

1兰州大学第二医院骨科，兰州 730030；2甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，兰州 730030；3西固区人民医院骨科，兰州 730060

下腰痛(low back pain，LBP)是最常见的肌肉骨骼疾病之一，与椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)密切相关[1]。据统计，多达80%的人一生中至少遭受一次LBP困扰[2]。IDD的主要病理改变为髓核(nucleus pulposus，NP)细胞减少和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分解，而目前的治疗策略(包括手术治疗和非手术治疗)均无法补充减少的NP细胞或逆转椎间盘退变的病理变化。近期研究发现，间充质干细胞可在一定条件下分化为NP样细胞，通过补充椎间盘内减少的NP细胞而延缓IDD进展[3-4]。目前用于研究治疗IDD的常用外源性干细胞主要包括髓核间充质干细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSCs)、脐带间充质干细胞及肌肉源性干细胞。其中BMSCs作为细胞治疗和组织工程中最常用的干细胞，在IDD治疗中表现出巨大优势，不仅可减缓椎间盘高度的下降，还可明显缓解患者的临床症状[5-6]。本文就近年来BMSCs及其外泌体在IDD治疗中的研究进展予以综述，以期为临床提供参考。

1 BMSCs概况

1.1 生物学特性 BMSCs是一类存在于骨髓中的非造血干细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能[7-9]，以及一定的归巢能力。其中归巢能力是指BMSCs能够迁移到受损部位然后分化为损伤部位的局部成分，并分泌有助于组织再生的趋化因子、细胞因子和生长因子。有研究证实，BMSCs的归巢能力可增强椎间盘细胞的存活和再生能力，预防IDD进一步恶化[10]，但其治疗效果在一定程度上取决于移植入损伤部位的时间以及归巢时各种化学因素(如趋化因子、细胞因子、生长因子等)和机械因素(剪切应力等)的影响[11]。有研究表明，肿瘤坏死因子超家族中的Fas可诱导BMSCs归巢[12]。如何通过技术手段提高BMSCs的归巢能力并适当调节外界因素以进一步提高其治愈能力，可能会成为新的研究方向。

1.2 治疗优势 目前干细胞研究主要集中于BMSCs和AMSCs，后者对IDD具有一定的治疗效果，干预后椎间盘高度下降速度减慢，Pfirrmann分级降低，组织学改变减轻[13]。Zhou等[14]将BMSCs和AMSCs分别与纤维环细胞共培养21 d，采用免疫组化、二甲基亚甲基蓝(DMMB)测定法以及定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测纤维环标记物胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖的表达，结果显示，在共培养的一段时间内，三种基因在BMSCs和ADSCs中的表达均增加，且可分化为纤维环(annulus fibrosus，AF)样细胞。其中纤维环标记物胶原蛋白Ⅰ在BMSCs中表达量最多，提示BMSCs具有更强的向纤维环样细胞分化的能力，作为纤维环修复的细胞来源可能更好。此外，BMSCs修复退变椎间盘内NP的能力强于AMSCs[15]。BMSCs移植治疗IDD是一种潜在的诱导椎间盘再生、ECM生长、向良好的合成代谢平衡转变以及减轻疼痛的方法，可能是治疗IDD的最佳种子细胞。

1.3 治疗潜能 BMSCs向骨、软骨等组织分化的能力及较强的自我增殖和免疫耐受特性为细胞移植治疗提供了可能。2003年Sakai等[16]首次发现BMSCs可以减缓兔椎间盘退变，为后续BMSCs在IDD中的研究奠定了基础。

目前BMSCs治疗退变椎间盘的作用机制已取得突破性进展。Risbud等[17]首次在体外条件下发现，BMSCs在低氧和转化生长因子-β1(TGF-β1)的诱导作用下可向NP样细胞分化，有助于补充退变椎间盘内减少的NP细胞。IDD常见于老年人群，与椎间盘细胞的过早衰老和功能障碍有关。Li等[18]采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导NP细胞衰老后与鼠BMSCs共培养，发现BMSCs可诱导NP细胞中衰老相关分泌表型的减少，并可促进NP细胞增殖和Ⅱ型胶原蛋白表达。衰老相关的锌金属肽酶STE24(ZMPSTE24)在衰老NP细胞中表达有所降低，但在与BMSCs共培养后得以恢复。BMSCs可能通过上调ZMPSTE24来减轻或预防NP纤维化并恢复NP的活力和功能状态。另有研究发现，BMSCs可通过抑制TLR2/NF-κB通路减缓IDD进展[19]。以上研究不同程度地证实了BMSCs对IDD的治疗是有 效的。

2 BMSCs移植治疗IDD

2.1 动物实验 近年来，BMSCs移植治疗IDD已在动物退变模型中得到证实。Teixeira等[20]将人BMSCs培养于牛退变椎间盘NP孔中，通过检测BMSCs的凋亡和迁移分析其对炎性环境的反应发现，退变椎间盘环境不影响干细胞的活力，可促进细胞向损伤部位迁移；干细胞可能通过旁分泌方式下调IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表达，提示BMSCs可能通过分泌细胞因子延缓IDD。

单纯注射BMSCs虽然具有一定疗效，但有时并不能取得较好的修复效果。Yan等[21]在兔IDD模型中通过检测移植后椎间盘内Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖、TGF-β1和水分含量，比较BMSCs移植和BMSCs联合不同浓度丹参酚酸移植的治疗效果，结果显示，丹参酚酸B(1～10 mg/L)联合BMSCs修复退变椎间盘的效果更优。Yi等[22]从新西兰兔中提取BMSCs，针刺诱导兔IDD模型，通过携带金属蛋白酶组织抑制因子1(hTIMP-1)的重组腺病毒载体转染获得转基因BMSCs(TBT组)。建模成功后分别移植到损伤诱导的变性椎间盘模型的NP中，然后检测椎间盘ECM含量和hTIMP-1的表达。与对照组(接受无细胞磷酸盐缓冲生理盐水)相比，TBT组和BT组(接受未改变的BMSCs移植)的退行性改变明显减轻，ECM含量明显增加，TBT组ECM含量高于BT组，hTIMP-1 mRNA和蛋白水平高于BT组。该研究表明，细胞移植通过携带药物或基因可能具有更佳的治疗效果，这可能会成为未来IDD细胞移植疗法的新途径。

2.2 人体实验 目前干细胞疗法已被广泛应用于临床治疗急性肺损伤、糖尿病、移植物抗宿主病、慢性缺血性心脏病、心力衰竭等疾病并取得了显著效果[23-27]。BMSCs已初步应用于临床IDD试验。一项研究调查了与自体BMSCs共培养后的NP细胞移植治疗IDD的安全性，共9例Ⅲ级IDD患者随访3年期间无不良事件发生，所有患者的椎间盘均未进一步退变，1例有明显改善，患者LBP评分降低，表明与BMSCs共培养后的NP细胞移植治疗有效，可在受试者中安全应用[28]。2019年Henriksson等[29]探讨了BMSCs移植后在4例(年龄分别为41、45、47和47岁)IDD患者体内的存在和分布规律。BMSCs用蔗糖铁标记，在移植8个月后可检测到BMSCs存活于椎间盘不同部位并分化为软骨细胞，刺激原有细胞产生ECM。一项经皮自体BMSCs注射再生椎间盘研究共纳入98例患者，注射前均接受非手术治疗，治疗后生活质量显著改善，在一年的随访中，平均残疾指数(ODI)从“严重残疾”提高到“最低残疾”，在注射部位未观察到其他不良事件，且无论干细胞的来源如何，患者的临床和放射学结果的整体改善均得到证实，随访期间并发症发生率很低[30]。

虽然上述少数病例研究临床疗效显著，且无明显不良反应，但存在较大的偏倚风险，以及样本量小和缺乏比较等问题，干细胞移植治疗IDD的有效性和安全性证据受到质疑。2019年Meisel等[31]从1039篇相关文献中筛选了10篇关于腰椎椎间盘细胞治疗的文献，最终纳入的8篇均为小规模病例研究，病例系列中有限的数据表明，细胞治疗对自体细胞来源的疼痛和功能可能有所改善，但这些变化是否具有临床意义尚不清楚，相关安全数据和报道较少。因此，尚需进行高质量的对比研究以及更多的临床试验研究证明细胞移植的可行性和安全性。

细胞移植可能引起免疫排异而导致移植失败。Shi等[32]比较了新生儿和兔真皮成纤维细胞在兔退变椎间盘中的宿主免疫应答，发现移植入兔椎间盘的人体细胞未较兔细胞引起更高的免疫应答，表明椎间盘能够耐受同种或异种移植。有研究证实，椎间盘退变、外伤等情况导致生理性屏障破坏，NP组织与免疫系统接触后会引起较严重的免疫反应，而在生理性屏障未破坏时免疫反应的发生风险较 低[33-34]。因此，在一定条件下细胞移植治疗人IDD的干细胞理论上也可来源于动物，但动物干细胞是否可在特定环境下如椎间盘纤维环未破裂时起作用，尚未发现相关报道。

2.3 生物材料支架 适当的细胞支架可以维持移植细胞的活力和功能，而水凝胶可模拟NP的天然ECM环境，并可为细胞提供结合位点，可能成为合适的细胞支架。Nakashima等[35]向兔受损椎间盘内注射交联透明质酸水凝胶和交联硫酸软骨素水凝胶发现，注射后椎间盘大多保留了MR的正常信号强度。Wang等[36]发现，在大鼠IDD模型中注射水凝胶加载的BMSCs可以延缓IDD，促进退化的椎间盘再生。Vickers等[37]从细胞水平验证了干细胞在NP凝胶中的生存能力和分化能力，证实N'-二甲基丙烯酰胺水凝胶可在不需要额外生长因子的情况下诱导人干细胞向NP细胞分化，并同时表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白。另有学者发现，氧化还原聚合的羧甲基纤维素水凝胶作为BMSCs载体也具有一定疗效[38]。 总之，以水凝胶为载体携带BMSCs植入退变的椎间盘可能是一种有效的治疗方案。

Zhang等[39]制备微囊化兔软骨细胞与BMSCs共培养，通过检测BMSCs细胞活性、Ⅱ型胶原蛋白和糖胺聚糖的表达发现，微囊共培养体系不会影响BMSCs的增殖，反而增强了其生成Ⅱ型胶原蛋白和糖胺聚糖的能力。体内实验结果显示，微囊化骨软骨细胞和BMSCs共培养组的椎间盘修复效果优于其他非微囊化骨软骨细胞组。此外，低温保存的微囊化BMSCs被证实具有修复退变椎间盘的效果，BMSCs包埋在藻酸盐微胶囊中，低氧低温贮藏后将微胶囊注射入牛离体的椎间盘NP中，发现NP细胞与BMSCs微胶囊共培养能产生更多的基质成分，相比于微囊化BMSCs，BMSCs在基质合成方面存在不足，这种差异在体外器官培养模型中得到了验 证[40]。随着研究的不断深入，Zhang等[41]在纳米水平研究发现，装载基质细胞衍生因子(SDF-1α)的白蛋白/肝素纳米粒子注入退变椎间盘可以诱导椎间盘再生，且对BMSCs归巢具有强有力的趋化作用。越来越多的研究表明，利用细胞与生物材料支架相结合的组织工程方法可以恢复椎间盘高度、再生ECM，从而延缓IDD，未来组织工程可能成为一个很有前景的治疗方案。

2.4 BMSCs移植疗法的局限性 干细胞在再生医学中表现出巨大的潜力，但目前诱导分化方案尚未完善，常用的诱导方案包括低氧环境、转化生长因子(如TGF-β1)、生长分化因子(GDF)家族成员等，部分方案脱离了NP的细胞外环境[17,42-44]。Xu等[45]开发了一种优化的脱细胞NP支架，保留了大部分的生物成分和规则的微观结构，并可在体外诱导干细胞分化成NP样细胞，但仍缺乏一定的实验依据。

既往研究表明，采用移植NP样细胞修复退变椎间盘，椎间盘无血管化时移植并不会引起炎症反应，可以降低排斥风险，但在已有异常血管长入NP组织时移植风险无法预测[46]。Maidhof等[47]评估了介入时机对椎间盘生物化学和生物力学的影响，在大鼠椎间盘穿刺损伤后第3、14和30天分别注入干细胞，结果显示，损伤后第3天给予的干细胞在椎间盘部位保留得最多，表明在疾病进展的早期阶段进行细胞治疗可能更有效，这可能是因为损伤相关的炎性微环境增强了间充质干细胞的活性，但早期细胞移植是否会带来其他风险尚未可知，且临床就诊患者多数已进入退变晚期。此外，在选择用于临床的NP干细胞来源时，应考虑由于椎间盘的退变环境而引起NP干细胞衰老的问题[48]。组织工程的应用似乎是目前较为有效的新型治疗措施，Vaudreuil等[49]利用一种可光聚合的生物凝胶支架将干细胞植入兔NP中，结果发现无法避免骨赘形成和纤维环破坏。

综上，虽然细胞移植疗法具有一定的治疗前景，但仍面临着巨大挑战：①如何确定细胞移植的最佳时间，以及如何准确判断退变开始的时间； ②移植后如何减少骨赘形成，减少不定向分化以及降低肿瘤发生的风险；③移植后的细胞存活率问题；④因移植操作而导致的纤维环破坏或其他并发症反而加快IDD；⑤如何避免或减缓干细胞衰老；⑥移植排斥反应。

3 BMSCs外泌体在IDD中的研究

3.1 外泌体的特点 随着细胞研究的不断深入，从细胞中分离的外泌体(exosomes)作为干细胞潜在的替代品成为现今关注的焦点。外泌体是几乎所有细胞类型都可产生的一种膜性囊泡，是细胞间通讯的关键信使[50]。干细胞是外泌体最常用的来源，干细胞来源的外泌体包含多种功能蛋白、mRNA、miRNA和信号脂质[51]，其直径在30～100 nm，来源于核内体并储存在多泡体中，通过与细胞膜融合将脂质、核酸、蛋白质等多种生物活性物质传递给受体细胞，引起受体细胞功能或活性改变，发挥细胞间物质交换和信息交流的作用[52-53]。外泌体具有性质稳定，易保存、易获取、易转化，无免疫原性等特点，具有广阔的应用空间。鉴于外泌体的多种功能和优势，注射携带特定基因和治疗药物的外泌体可能会成为IDD无细胞治疗策略的合适选择[54]。

3.2 外泌体在其他疾病中的应用 外泌体在医学治疗上具有多种潜能，目前的研究集中于肿瘤、药物输送和再生医学领域[55]。外泌体的特征是小RNA的聚集，包括mRNA、miRNA、tRNA和lncRNA[56-57]。这些RNA分子和蛋白质一起作为遗传物质，通过外泌体的转移在细胞通讯中发挥至关重要的作用[58]。外泌体中的RNA主要是miRNA，具有多种生物功能。Valadi等[59]研究发现，小鼠外泌体miRNA转移至人肥大细胞后，在受体细胞中发现了新的小鼠蛋白。外泌体作为载体转运遗传物质，通过诱导受体细胞功能和活性的改变，引起细胞行为的改变。随着生物医学的发展，外泌体正迅速发展为一种新的肿瘤治疗方法，临床上可用于疾病诊断(标志物、液体活检)[60]、药物载体[61-62]、疾病靶标[63]以及预后监测[64]。目前干细胞外泌体已在多种疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，包括骨关节炎、膀胱癌、恶性肿瘤、皮瓣损伤修复、眼病等[65-69]，但在IDD中的研究目前仍处于起步阶段，深入了解外泌体形成的亚细胞成分和机制以及特定的细胞靶向具有重要意义。

3.3 外泌体的分离、鉴定和储存 目前外泌体的分离方法主要包括超速离心法和聚合物沉淀法，其中超速离心法包括简单超速离心、密度缓冲离心和密度梯度离心，在产量上差异很小。简单超速离心是分离外泌体最常用的方法，会产生更多的蛋白质污染和外泌体的聚集[70]。而外泌体商业试剂由于会引起严重的聚集和污染并不适用于临床。因此，目前外泌体治疗面临的最大困境是外泌体的提取产量较低，以及如何维持提取外泌体的物理性质并防止其污染。外泌体鉴定方法包括形态学鉴定(电镜)、粒子大小分析(粒径分析)及标志蛋白鉴定(Western blotting)。其中透射电镜可以清楚地观察到外泌体的大小、形态，属于鉴定方法的金标准。外泌体的储存条件为-80 ℃下存储于磷酸盐缓冲液中，先前研究表明在较高温度下储存会减少外泌体及其内含物的数量，而在-80 ℃下储存则变化较小[71]。

3.4 BMSCs外泌体治疗IDD

3.4.1 作用机制 目前BMSCs外泌体(BMSCs-exo)修复退变椎间盘的作用机制研究已取得一定成果。2019年一项研究表明，椎间盘内NP细胞来源的外泌体可促进BMSCs迁移并诱导其向NP样细胞分化，可能与Notch1通路的抑制相关，并且其分化能力强于细胞间接共培养[72]。Cheng等[73]发现BMSCsexo可以抑制TNF-α诱导的NP细胞凋亡，这可能与外泌体miR-21通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt通路靶向磷酸酶和紧张素同系物(PTEN)转入NP细胞有关。Liao等[74]采用RNA干扰、免疫组化等方式评价了BMSCs-exo的作用机制和治疗效果，发现退变椎间盘组织内质网应激水平和凋亡率升高，外泌体通过激活Akt和ERK信号通路减弱内质网应激诱导的细胞凋亡，并且在大鼠模型中得到验证，首次证实了BMSCs-exo可以调节年龄相关椎间盘变性时应激诱导的细胞凋亡。有研究表明，过度的氧化应激和炎症反应是IDD发生的关键早期事件，而NLRP3炎性小体是引起氧化应激和炎症反应的主要原因。Xia等[75]发现，在兔退变椎间盘内，BMSCs-exo通过抑制炎性介质和NLRP3炎性小体的活化在NP细胞中发挥抗炎作用，显著阻止了退行性变的发生。此外还发现，外泌体可为NP细胞提供线粒体蛋白，通过补充外泌体可以修复受损的线粒体。

3.4.2 应用优缺点 外泌体的应用避免了干细胞移植的免疫排斥反应，其性质稳定，易保存、易获取、易转化，并具有较低的免疫原性。基因治疗和细胞因子治疗是延缓甚至逆转IDD的新途径[76]，但将外源性基因导入椎间盘细胞仍是一个难题，而外泌体是一种有希望的非病毒基因治疗载体，越来越多的实验证实了外泌体在IDD中的治疗作用，进一步研究其作用机制具有重要意义。

外泌体治疗剂的开发面临诸多挑战，生产率较低，商业化制备的外泌体因具有严重的蛋白质污染和聚集而无法用于临床治疗。由于其异质性和低生产率，生产外泌体制剂是治疗应用的主要障碍，需要开发和优化生产方法，包括分离和储存外泌体制剂的方法。此外，外泌体的治疗潜力和递送效率的提高对其临床应用亦非常重要[77]。外泌体有望成为治疗各种疾病的有效治疗剂，因此应开发用于大规模生产的方法，同时优化分离和储存的方法。

3.4.3 治疗前景 已有研究初步表明了BMSCs-exo在治疗IDD中的巨大潜力。BMSCs-exo可促进退化NP细胞增殖和健康ECM生成[54]。NP细胞来源的外泌体可促进BMSCs迁移并诱导BMSCs分化为NP样表型。外泌体作为BMSCs与NP细胞间信息交流的重要工具，具有多种功能和多重优势，单独应用或装载特定基因和药物是无细胞治疗IDD的新型策 略[54]。一旦外泌体的特性和生物学特征得到更好的阐释，将具有非常广阔的应用前景。

4 总结与展望

综上所述，BMSCs移植可以延缓IDD，但其局限性限制了干细胞组织工程疗法的普及。外泌体由于其易保存、无免疫原性等优势而受到研究者的广泛关注，但存在提取率低、量少等问题，随着研究的不断深入，推测在不久的将来注射携带外源性基因或药物的BMSCs-exo以减缓人椎间盘的退变，可能成为一种新型有效的治疗策略。