激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

温家福，韦标方

1山东第一医科大学研究生处，山东泰安 271000；2临沂市人民医院股骨头专科，山东临沂 276000

激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)是临床常见且难治的骨科疾病，病情往往发展迅速，在持续性应力作用下，后期会出现股骨头坏死区塌陷，最终发展为髋关节功能障碍。为了避免后期行髋关节置换，早期保髋治疗尤为重要。目前，随着分子生物学的迅速发展，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在SONFH早期治疗中受到了广泛的关注。本文主要就诱导SONFH患者BMSCs成骨分化的影响因素进行综述，以期通过施加外界干预来增强BMSCs的成骨分化，抑制成脂分化，提高BMSCs的临床疗效。

1 SONFH的病因及发病机制

SONFH是由于长期或大剂量应用激素类药物，致使骨髓腔内脂肪细胞数量增多、体积增大，造血细胞数量减少，脂肪细胞堆积引起骨髓腔内压增高，髓腔内血管受到挤压，股骨头静脉回流受阻，血液瘀滞，血管栓塞，从而引起股骨头微循环障碍，股骨头出现缺血性坏死。国内一项流行病学研究显示，24.1%的股骨头坏死(ONFH)是由类固醇诱导产生的，46.63%的SONFH患者合并自身免疫性疾病，以系统性红斑狼疮(SLE)最为常见[1]。国内外专家和学者比较认可的SONFH发病机制学说主要有以下几种：①脂质代谢紊乱及骨内压增高学说；②血管内凝血与血管损伤学说；③骨细胞凋亡学说；④基因控制学说[2]。有研究发现，糖皮质激素可通过激活或抑制成骨和成脂细胞相关调控基因的表达来调节BMSCs的分化。在激素作用下，BMSCs成脂分化增强，成骨分化减弱，最终因脂质代谢紊乱而引起一系列病理生理变化，最终导致SONFH。具体机制如下：①激素诱导BMSCs成脂分化。激素的局部代谢可通过一种特定站点的方式调控脂肪组织的分化；长期使用激素可促进前脂肪细胞分化为脂肪细胞；激素可拮抗Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)对BMSCs的成骨分化；激素可诱导脂肪酸结合蛋白分化基因的表达。②激素抑制BMSCs的成骨分化：激素过量使用可促进成骨细胞和骨细胞凋亡，增加破骨细胞的数量；激素能诱导BMSCs分化为脂肪细胞和成骨细胞，但不能诱导终端成骨细胞的分化；糖皮质激素可通过抑制单体糖皮质激素受体二聚化来抑制骨形成，还可增强软骨细胞外基质基因的表达，促进BMSCs向软骨细胞分化[3-7]。

有研究表明，SONFH患者自体BMSCs的成骨活性和增殖能力显著下降[8]。有学者对健康兔和SONFH模型兔进行解剖学观察，发现SONFH模型兔软骨下区空骨陷窝率显著增高，脂肪细胞数量增多，排列紊乱，骨组织减少，HE染色可见均质红染的坏死区。短期大剂量糖皮质激素冲击可显著抑制血管内皮生长因子-α的表达[9]。Hernigou等[10]发现，SONFH可能与骨髓活性减弱有关，脂肪细胞和成骨细胞共用一个干细胞池，类固醇类激素可诱导BMSCs向脂肪细胞分化；干细胞池的减少会降低成骨能力，使BMSCs的数量难以提供足够的成骨细胞来满足骨重塑，最终导致骨坏死。而SONFH患者骨髓活力的降低可能与病变部位的脂肪栓塞、压力改变、血液循环障碍、凝血障碍等因素有关。

2 BMSCs的生物学特性及应用

BMSCs具有多向分化的潜能，来源于中胚层，整体呈菊花状或同心圆状排列，在骨髓组织中含量最为丰富，可在特定环境下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等中胚层细胞，也可分化为神经元细胞和血管内皮细胞等外胚层细胞[11-12]。 除自我增殖和多向分化的特性外，BMSCs还具有表面抗原非专一性、可移植性、贴壁性、可塑性强、免疫原性低、可旁分泌多种生物活性因子、致畸致瘤性低、易于获取等特点[13-16]。此外，基因转染技术和组织工程技术成为BMSCs治疗ONFH的新 趋势。

BMSCs植入可增加股骨头干细胞的供应，有助于骨坏死的修复，另外骨髓基质细胞可分泌血管生长因子，促进血管生成，增加坏死区的血液供应，改善成骨。有研究证实，植入的BMSCs和自体已分化和未分化的干细胞一起协调分化，可实现组织的功能性修复。可通过髋关节评分、影像学评估结果及最终是否有必要接受髋关节置换术等指标来评估BMSCs治疗SONFH的效果。Hernigou等[17]对343例ONFH患者(534髋)进行BMSCs自体移植后的回顾性分析显示，平均随访12年后371髋股骨头坏死的体积从26 cm³减少到12 cm³，仅94髋进展至全髋关节置换阶段，表明BMSCs自体移植在股骨头坏死治疗中取得了较好的效果。

有学者曾用BMSCs移植治疗早期SONFH，但发现移植的BMSCs在股骨头坏死区氧化应激的微环境中发生了衰老和凋亡，并不能良好地生存。进一步探索发现，坏死区的氧化应激导致p53蛋白表达上调，抑制了Parkin的线粒体转位，激活了E3泛素 蛋白连接酶活性，降低了线粒体自噬的水平，造成受损的线粒体积累，进而导致BMSCs衰老和凋亡[18]。 总之，促进BMSCs的增殖和成骨分化，可进一步提高其治疗SONFH的效果。

3 影响SONFH患者BMSCs增殖和成骨分化的因素

3.1 中医中药 陈镇秋等[19]研究祛痰逐瘀法(二陈汤和桃红四物汤加减组成)治疗SONFH兔的效果，发现模型组兔空骨陷窝率明显高于正常组，高剂量中药组明显低于模型组和中低剂量中药组，高剂量中药组兔BMSCs第72小时的增殖能力和碱性磷酸酶(ALP)活性明显高于其他4组。

周李学[20]的研究发现，补肾活血汤能调节体内钙磷代谢，加速基质合成，改善骨质疏松状态，提高股骨头强度，使骨在结构力学和材料力学方面得到重塑与稳定。相较对照组，模型组和治疗组兔成骨相关因子Wnt11、sFRP2、FZD6、Ror2的表达水平随时间延长而增高，成脂相关蛋白Wnt5b、sFRP4、DKK1的表达水平明显下降，从而促进了BMSCs的成骨转化，抑制其向脂肪细胞转化。施乐等[21]的研究发现，补肾活血汤具有上调Wnt/β-catenin信号通路以及血管内皮生长因子(VEGF)表达的作用，可促进骨骼组织血管的生成，从而治疗SONFH大鼠。

吴云刚等[22]研究发现，右归饮对SONFH患者股骨近端BMSCs的增殖和成骨分化起促进作用。刘锌等[23]发现，右归饮能显著提高SONFH大鼠BMSCs的增殖能力，但高、中、低3种剂量并无明显差异；此外，还能够上调SONFH模型大鼠中BMSCs的成骨分化，下调其成脂分化。

Kong等[24]发现，从活骨方中提取的乙酸乙酯可通过调节骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt信号通路，显著抑制BMSCs的脂肪生成，并轻微促进BMSCs成骨。分析其分子机制可能与活骨方中的乙酸乙酯能降低过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、 脂蛋白脂肪酶(LPL)和脂肪细胞蛋白2(AP2)的mRNA和蛋白表达水平有关。

时利军等[25]发现，淫羊藿苷(ICA)对激素诱导的兔早期SONFH具有保护作用，可以抑制骨细胞凋亡，改善骨微结构，延缓骨坏死进展。黄增发[26]研究发现，一定浓度的ICA能部分纠正BMSCs成骨成脂分化的不平衡，10-9～10-5mmol/L ICA均能增加BMSCs的增殖活性。三酰甘油(TG)含量测定结果显示，激素可增加BMSCs成脂分化过程中TG的含量，而ICA能部分逆转该过程。实时定量PCR检测结果显示，ICA+激素组成脂相关因子PPARγ mRNA的表达水平高于正常组，低于激素干预组；油红O染色可见，ICA+激素组较正常组脂滴数量增多且体积增大，较激素干预组脂滴数量减少。

Jiang等[27]发现，牛膝提取物(ABE)能通过减少骨坏死和骨髓脂肪生成来减轻大鼠SONFH；能够改善骨小梁的显微结构，增加骨密度；增加大鼠股骨头血管新生，改善高血脂状态；抑制破骨细胞分化，改善骨形成。主要机制可能为ABE能够拮抗骨保护素(OPG)下调、核因子κB受体活化因子(RANK)和RANK配体(RANKL)上调、RANK与OPG在血清和股骨头坏死中的比例升高，同时有效抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，调节RANKL和OPG在体外的表达。

于涛[28]通过观察中药红花活血化瘀的有效成分羟基红花黄色素A(HSYA)对SONFH相关指标的影响来研究其作用，发现HSYA可抑制激素诱导的BMSCs成脂分化。药物干预组油红O染色不如激素组明显，三酰甘油含量、PPARγ mRNA的表达水平明显低于激素组。

桂先革等[29]研究发现，三七提取液可以有效改善SONFH兔股骨头坏死组织的修复，提高骨密度，同时提高VEGF和OPG的作用效果。

刘予豪[30]的研究发现，SONFH骨质中活性氧(ROS)引起的破骨细胞活性增强是塌陷的一个病理基础，龙血素B(LrB)可通过Keap1/Nrf2/ARE信号轴有效抑制ROS活性，从而促进SONFH的修复。

3.2 物理因素 有研究发现，一定强度的体外震波[31]可促进SONFH患者坏死区BMSCs的增殖，并诱导其向成骨细胞分化。将BMSCs无血清培养24 h后施以5 kV/500 Hz体外震波干预10 min，结果发现体外震波组细胞传代后进入增殖高峰期较空白对照组早，呈现出成骨分化的趋势，而空白对照组细胞则呈现向其他类型细胞多向分化的趋势。体外震波组核心结合因子α1 mRNA和骨钙素mRNA的表达较空白对照组显著增高。

高压氧疗法(HBOT)治疗SONFH的机制尚不清楚，但多项研究表明，HBOT可抑制过量使用激素导致的成骨与破骨失衡[32]。Bosco等[33]研究发现，HBOT能够调节与体内活性氧簇相关的信号转导通路，从而改善机体血液循环；还能够降低TNF-α、IL-6的水平，抑制破骨细胞分化，减少骨吸收。

低频脉冲电磁场(LF PEMF)是治疗早期SONFH的一种有效手段。李建平[34]发现，施加干预因素组骨组织空骨陷窝率明显低于模型组；模型组股骨头组织PPARγ2 mRNA的表达水平显著高于施加干预因素组和空白对照组，而Runt2 mRNA的表达水平则显著低于施加干预因素组和空白对照组。表明LF PEMF能够上调Runt2的表达，下调PPARγ2的表达，促进成骨，抑制成脂作用，降低骨坏死率。

3.3 生物化学制剂 张月雷[35]预防性应用维生素K2(VK2)干预SONFH大鼠，结果发现，VK2促进了骨钙素的羧化，促进成骨，降低了激素干预大鼠ONFH的发生率，同时有助于股骨头骨小梁的完整和相关蛋白的表达，保护股骨头血供。

丙戊酸(VPA)是一种广泛应用于抗癫痫和抗惊厥的药物，有文献报道，VPA作为组蛋白乙酰化酶的抑制剂能够促进BMSCs成骨分化。周鼎[36]发现，VPA能够促进hBMSCs成骨相关基因和蛋白的表达，促进ALP活性及钙盐沉积，削弱激素对hBMSCs成骨的抑制作用；还能够预防大鼠ONFH的发生，降低骨小梁空骨陷窝率，改善血液灌注。

张立岩[37]发现，大豆异黄酮(SI)干预8周后，早期SONFH兔骨组织中Runx2、Col-1、骨钙素(OCN) mRNA表达水平较模型组升高，PPARγ mRNA表达水平较模型组降低，表明SI可通过调控PPARγ信号通路增强BMSCs的成骨作用。

富血小板血浆(PRP)是血小板的浓缩物，其中富含血小板和细胞生长因子，能够促进BMSCs的增殖和成骨分化。陈得胜[38]通过实验证实，BMSCs可通过PRP的诱导向成骨细胞分化，软骨支架为BMSCs的成骨分化提供了良好的空间结构，PRP联合软骨支架可促进兔SONFH的修复。

代志鹏[39]研究证实，谷胱甘肽(GSH)能够逆转激素诱导的细胞内ROS水平增高，上调细胞内Runx2、ALP的表达水平，下调PPARγ、C/EBP的表达。另外10、50 μmol/L GSH的成骨分化作用较5 μmol/L GSH更为显著，表明GSH可以通过降低细胞内ROS的水平来增强成骨分化，减弱成脂分化。

有学者发现，15 μmol/L 5'-氮杂胞苷(5'-Aza-dc)能够促进SONFH患者BMSCs的增殖。油红O染色、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、PPARγ mRNA和蛋白测定结果显示，干预组成脂分化能力接近正常组；ALP检测、茜素红染色、骨钙素mRNA和蛋白测定结果显示，干预组BMSCs的成骨分化能力较模型组显著提高，接近正常组。表明5'-Aza-dc可通过改变BMSCs成骨和成脂分化的平衡，促进细胞增殖，进一步改善早期SONFH[40-41]。

张磊[42]采用MTT法检测不同浓度二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)对BMSCs增殖的影响，结果发现，与对照组相比，0.5 mmol/L DMOG对BMSCs的增殖无明显抑制作用，但能明显上调ALP活性以及Runx2、Osterix mRNA的表达，并增强茜素红染色效果。建立兔SONFH模型，将实验对象分为阴性对照组、单纯髓芯减压组、髓芯减压+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组、髓芯减压+DMOG+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组，干预12周后，MRI检测结果显示，阴性对照组信号减低的范围扩大且股骨头轻微塌陷；单纯髓芯减压组信号减低但好于阴性对照组，股骨头外形无明显异常；髓芯减压+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组股骨头信号仍有减低但好于单纯髓芯减压组，且股骨头外形正常；髓芯减压+ DMOG+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组股骨头信号轻微减低，明显好于单纯髓芯减压组和髓芯减压+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组。免疫组化染色结果显示，髓芯减压+DMOG+BMSCs生物蛋白胶复合物移植组VEGF和Runx2表达呈强阳性，较其他3组更明显。表明DMOG能够通过调控Bcl-2/Bax表达的比例而对抗因缺血清培养而引起的凋亡，促进BMSCs的成骨分化。髓芯减压+DMOG+BMSCs生物蛋白胶复合物能够促进股骨头局部成骨与血管生成，进而促进ONFH的修复。

3.4 组织工程技术 有研究发现，早期移植生长分化因子11(GDF11)表达沉默的BMSCs可有效促进大鼠股骨头坏死区成骨。通过转染小分子干扰RNA(siRNA)以沉默大鼠BMSCs中GDF11的表达，结果显示，转染siRNA对大鼠BMSCs活性无影响，实验组ALP活性与钙结节数量优于模型组，ALP、Runx2、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白α1链的mRNA相对表达量较模型组显著升高。动物实验可见，实验组大鼠股骨头密度较模型组升高，骨结构更完整，且Runx2和Ⅰ型胶原表达量升高[43]。

王博[44]应用慢病毒转染BMSCs，下调SONFH来源的BMSCs的HDAC9表达，诱导分化后，转染组钙结节与小管数量均减少，脂滴数明显增多，成骨相关蛋白Runx2、OCN的含量低于未转染组，成血管相关蛋白血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、CD31的含量显著低于未转染组，而成脂相关蛋白PPARγ的含量高于未转染组。表明下调HDAC9的表达可导致BMSCs的成骨和成血管能力降低，成脂分化能力增强，破坏了骨代谢平衡。

长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200 bp且不编码蛋白的RNA，能够调控细胞分化和基因表达等[45]。王庆宇[46]通过敲低及过表达lncRNA HOTAIR的方法检测SONFH患者BMSCs的成骨及成脂分化的能力，结果发现，低表达HOTAIR后SONFH患者成骨分化能力增强，成脂分化能力减弱，而过表达HOTAIR后则出现相反结果。另外，lncRNA RP1-193H18.2和MALAT1与SONFH患者BMSCs的成骨和脂肪分化异常有关。有学者证实，lncRNA RP11-154D6促进了BMSCs的成骨分化[47]。项帅[48]发现，lncRNA RP11-154D6可以抑制BMSCs增殖并促进其凋亡，而lncRNA RP3-331H24.6和RP3-331H24.7能够促进BMSCs增殖并抑制其凋亡。

miRNA是具有高度保守性、时序性和组织特异性的单链小分子RNA，对于细胞的组织功能以及生命活动起着至关重要的调控作用。最新研究发现，miRNA在BMSCs的增殖和多向分化过程中起重要调控作用。王傲[49]发现，miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p可能为BMSCs成骨分化的负向调节因子，可抑制成骨分化；而miR-122-3p可能为BMSCs成骨分化的正向调节因子，可促进成骨分化。李明[50]的研究发现，miRNA-27a能抑制成脂基因的表达，促进成骨基因的表达，因此可通过miRNA-27a的多向靶向调控特性来预防并干预SONFH。李涛[51]发现，miR-23a能够抑制BMSCs的成骨分化，其靶基因为LRP5，可通过Wnt通路抑制BMSCs的成骨分化。郝铖[52]也发现，miR-708能够调控BMSCs的成骨分化，以SMAD3为靶基因，最终导致BMSCs的成骨分化能力下降，促进了SONFH的发生与发展。此外研究发现，miRNA-206、miRNA-34b、miRNA-34c、miRNA-148a、miRNA-21、miRNA-652与BMSCs的成骨分化相关[53]。有研究发现，沉默miR-137-3p可直接作用于Runx2和CXCL12基因，促进成骨分化和激活内皮祖细胞[54]。冯林等[55]研究发现，miR-146a-5p可能参与调控SONFH的病理过程，其机制可能为激素下调了miR-146a-5p的表达，引起组织坏死，最终导致SONFH。

骨组织神经参与了骨代谢，其中以肽能神经与骨的关系最为紧密。肽能神经通过分泌神经肽产生生物效应，其中以降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)和P物质(substance P，SP)的作用最为明显。CGRP和SP分别作用于骨组织内各种细胞上的相应受体，调节骨修复与重建，影响骨代谢。有研究证实，激素能下调hBMSCs中CGRP受体、SP受体mRNA的表达，抑制hBMSCs增殖及成骨分化[56-57]。

表观遗传学是研究在没有细胞核DNA序列改变的情况下，基因功能的可逆的、可遗传的改变。这种改变包括DNA的修饰(如甲基化修饰)和组蛋白的修饰(如甲基化、乙酰化和磷酸化)等。表观遗传调控在干细胞分化过程中意义重大。干细胞在从全能性至终末分化的每一个阶段都需要建立表观遗传状态。孙志博[58]用5'-Aza-dc干预进行BMSCs的重编程，8周后可观察到重编程组BMSCs增殖能力最强，同时能恢复BMSCs干性基因OCT4、NANOG和ABCB1的表达及其成骨分化能力。也有研究表明，组蛋白去甲基化酶家族基因的整体功能与hBMSCs的成骨分化有关，KDM6A可能与SONFH的发病机制有关，KMD4A是hBMSCs成骨分化的重要调控基因，主要通过Runx2-OPN/ALP信号通路调节成骨 分化[59]。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类共价闭合非编码RNA，许多证据表明，circRNA能够通过不同途径影响基因表达，从而调控疾病的发生发展[60]。陈高杨[61]通过RNA干扰实验发现，敲低CDR1as后，BMSCs的成骨分化能力增强，成脂分化能力减弱，而CDR1as过表达实验中则出现相反结果。

综上所述，随着临床研究的不断深入，早期SONFH的病因、发病机制和治疗将逐渐完善。由于BMSCs具有易于获取及自我增殖和多向分化的特性，其移植在临床上的应用将更加广泛。BMSCs成骨和成脂分化能力的不平衡是造成SONFH的主要原因。有学者发现，部分中药方剂及其提取物对BMSCs的成骨具有一定的促进作用，还可通过一些物理方式的治疗和生物化学制剂来诱导BMSCs的成骨，抑制其成脂分化。另外，通过对BMSCs特定靶点进行调控，将其敲低或过表达，对治疗SONFH具有一定促进作用。目前的研究多局限于体外或动物实验，由于人体内环境的影响，BMSCs在体内定向分化成某种细胞的成功率有待提高。SONFH早期保髋治疗的机制，以及BMSCs在人体内的定向成骨分化仍需要大量的临床实践和研究。相信随着现代医学的不断发展，BMSCs在SONFH的治疗中将会发挥更大的作用。